Imunomodulatoore metaboliite sin en xlisel fon te tumor mikroklimaat (TME), awer mit phaar ausnaame, kept sayn itentiteet fer ti kans welt noch net pekhant. Hier, hon mer ti tumore un T-kleewer fon te tumore un ascite fon te patiënte mit hooche xpiichel fon te seroose karsinoom (HGSC) analysiert, fer ti metaboloome fon tëne unerxiitliche TME-kompartmënte se pekhant mache. Ascites un tumor xëlcher hon kroose metaalixe unerxiite. Im ferklaych mit te ascite, ti tumor-infiltratsioons T-kleewer sin signifikant ferkreest in 1-metilnikotinamid (MNA). Opwool te niwel fon MNA in te T-kleewer hooch is, is ti ekspresioon fon te nikotinamiid N-metiltransferase (en enzym woo ti transfusioon fon metil krupe fon S-adenosilmetionin in nikotinamiid katalyseyert) fer ti fibroblaste un tumor xëlcher limiteyert. Funktsioons, MNA influëntsiert ti T-kleewer fer ti tumor-promotsioons citokiin tumor nekrose faktor alfa se sekreteere. Tesweche, tuut te TME-petaytungs MNA ti imuniteet fon te T-kleewer mit hale un representeyert en potensial imunoterapii zil fer ti tratamënt fon mënxliche kanser.
Tumor-petaytungs metaale khëne en tiif inhikeriche efekt hon uf ti anti-tumor immuniteet, un imer mee pewaysunge tsayche tas se aach als xlisel trefungs kraft fer ti krankheet prokressiooon tiine khëne (1). Neekst te Warburg-Efëkt, hot ti letste aarwat aankefang te metaalixe xtel fon te tumor seele un sayn relatsioon mit em imuniteet xtel fon te tumor mikroklima (TME) se karakteriseere. Studiie fon muus modele un mënxliche T-kleewer hon ketsaycht tas te metabolismus fon te glutamin (2), te oksiijen metaboliismus (3) un te glukoos metabolismus (4) khan unaafhängich fon te ferxiitne imuniteet xëlcher unerxritunge xafe. Meyerxte metaalixe metaale in tiise weech tuun ti anti-tumor funktsioon fon te T-kleewer inhiweyere. Es is pewayst kep tas ti xtek fon te koenzym tetrahidrobiopterin (BH4) ti proliferatsioon fon te T-kleewer ferxwine khan, un ti ferkreesung fon te BH4 im khërper khan ti anti-tumor imuniteet antwort ferxtërke, woo fon CD4 un CD8 fermixt kept. Tsum payxpiil, te imunosupresiif efekt fon te kynurenine khan torich ti influëns fon BH4 keret kewe (5). In isositraat dehidrogenase (IDH) mutante glioklastoom, ti sekwëns fon enantiometabolixe (R)-2-hidroksiglutaraat (R-2-HG) inhiweyert ti T-kleewer aktiviteet, proliferatsioon un citolyse Aktiwiteet (6). In te letste yoore, is ketsaycht kep tas metilglioxal, en neekst protukt fon te glikose, fon suprësor xëlcher fon myeloid orixin protutseert kept, un ti T-kleewer transferëns fon metilglioxal khan ti efektor T-kleewer funktsioon inhiweyere. In te tratamënt, khan ti neutralisatsioon fon metilglioxal ti aktiwiteet fon te myeloid-petaytungs xpiichle (MDSC) iwerwinere un ti kontrol-punkt blokeere therapii in muus modele sinerjix ferxtërke (7). Ti xtuutium tuun kolektiife ti xlisel rol fon te TME-petaytungs metaale in te rekularisierung fon te T-kleewer funktsioon un aktiwiteet petayte.
T-kleewer dysfunktsioon is fiil kexproch kep in oowe kanser (8). Tas is teels weeche ti metaalixe karakteristike woo in te hipoxii un ti anormaale tumore vaskulature inherent sin (9), was ti konwersatsioon fon te glukoose un tryptofan in neekste protukte wii milk asiat un kynurenin pringt. Ekstra ekstraselulaar laktat reduktiirt ti protuktsioon fon interferoon-γ (IFN-γ) un macht ti tiferensiatsioon fon te myelosupresiif unerxritunge (10, 11). Ti konsumtsioon fon tryptofan hëleft ti proliferatsioon fon te T-kleewer direktsioon un hëleft ti T-kleewer reseptor signaale (12-14). Trokne tiise opserwayrunge, is fiil aarwat um te imuniteet metaboliismus rom kemacht kep in in vitro T-kleewer kultuur mit te penutsung fon optimistixe mëdia, ore limiteyert uf homolookixe moter modele in vivo, woo khee fon tëne ti heterojeneiteet fon te mënxliche kanser un ti Physiolookix Makro un Mikro Umwelt kans reflekteyert.
Een kewoonlich phunkt fon te oowe kanser is ti peritoneal ferpraytung un ti ausxtëlung fon ascites. Ti akkumulatsioon fon te xël flus in te ascites is mit forterung fon te krankheet un xlechte proknoose ferpun (15). Soo wii ti pekhante aus keleet hon, is tee unike kompartmënt hipoksii, hot hooche niwele fon vaskulaare endokriine wakstum faktor (VEGF) un indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO), un is infiltriert kep fon T-rekulaare xëlcher un myeloide inhikericher xëlcher (15-18). Ti metaalixe umfeltung fon te ascites khan anerxter sin wii ti tumor selepst, soo tas ti reprotuktsioon fon te T-kleewer im peritoneal raum net klaar is. Tsum payxpiil, ti xlisel unerxiite un heterojeneiteet tswixe ascite un metaboliite woo in te tumor umwantung present sin, khan ti infiltratsioon fon imuniteet seele un sayn funktsioon uf tumore hinerkeen, un noch mee forxunge sin neetich.
Um tiise propleeme se lëye, hon mer en sensiiwle xël separatsioon un fliisich chromatokrafii tandem mass spektrometrii (LC-MS/MS) methook kexrip, fer ti ferxiitne xël sorte (inklusiif CD4 + un CD8 + T xël) xtuteere, soo wii in un tswixe tumore Sayn metaboliite xpant xël in te selwich ascite un tumor patiënt umfelt. Meyer penutse tiise methook in ferklaychung mit hooch-dimensionaal flus tsitometrii un eensichste xpiichel RNA-sekwëns (scRNA-seq) fer en hooch resolutsioons portret fon te metaalixe status fon tëne xlisel populatsioone. Tiise methook hot en simpoolix ferkreeserung fom niwel fon 1-metilnikotinamiid (MNA) in te tumor T-kleewer ketsaycht, un in vitro xpiichle hon ketsaycht tas te imunomodulatoor efekt fon MNA uf ti T-kleewer funktsioon foer heyer net pekhant waar. Im kansem, tuut tiise methook ti wechselseechliche metaalixe interaktsioone tswixe tumore un imuniteet seele orkaniseere, un kept unike insicht in imuniteet rekulaar metaalixe metaale, woo nutslich sin khëne fer ti tratamënt fon T-kleewer-basierte oowe kanser imunoterapii Tratamënt oportuniteete.
Meyer hon ti hooch-dimensional flus tsitometrii penutst fer ti glukoos uf nëmung simultaan kwantifitseere [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoksiglukoos (2-NBDG) un ti mitochondrial aktiwiteet sin [MitoTracker Deep Red, MT2de) tipixe marke woo ti imuniteet fon te mënxe un ti tumore fon te mënxe unerxiite (Taatel S2 un Fikuur S1A). Tiise analyse hot ketsaycht tas, im ferklaych mit te T-kleewer, ti ascites un ti tumor-kleewer hon mee glukoos uf nëmungs niwele, awer hon kleenere unerxiite in te mitochondriale aktiwiteete. Ti tswixe glukoos uf nëmung fon te tumor xëlcher [CD45-EpCAM (EpCAM)+] is tray pis fier mool soo kroos wii ti fon te T-xëlcher, un ti tswixe glukoos uf nëmung fon te CD4 + T-xëlcher is 1,2 mool soo kroos wii ti fon te CD8 + T-xëlcher, was tsaycht tas ti tumor infiltratsioons lymfotsiite in te metabolixe TME (TIL) hon unerxiitliche metaale). Im keeche teel, ti mitochondrial aktiwiteet in te tumor xëlcher is ëkstra fer ti CD4 + T xëlcher, un ti mitochondrial aktiwiteet fon te tswaay xëlcher sorte is heecher wii ti fon te CD8 + T xëlcher (Figura 1B). Im kansem, tiise resultaate tsayche tas metaalixe niwel. Ti metaalixe aktiwiteete fon te tumor xëlcher sin heecher wii ti fon te CD4 + T xëlcher, un ti metaalixe aktiwiteete fon te CD4 + T xëlcher sin heecher wii ti fon te CD8 + T xëlcher. Trokne tiise efekte iwer ti kanse xëlcher sorte, kept es khee konsistens unerxiit in te metaalixe status fon CD4 + un CD8 + T xëlcher ore sayn relative proportsioone in te ascites ferklaycht mit te tumore (Figura 1C). Im keeche teel, in te CD45-kleewer fraktsioon, is te proportsioon fon EpCAM+-kleewer in te tumor kewakst, ferklaycht mit te ascites (Figura 1D). Meyer hon aach en klaare metaalixe unerxiit tswixe EpCAM+ un EpCAM- xël komponiinte ketsaycht. EpCAM+ (tumor) xëlcher hon mee glukoos uf nëmung un mitochondrial aktiwiteet wii ti EpCAM- xëlcher, was fiil heecher is wii ti metaalixe aktiwiteete fon te fiproniin in tumor xëlcher in TME (Figura 1, E un F).
(A un B) Mittel fluoresëns intensiteet (MFI) fon te glukoos uf nëmung (2-NBDG) (A) un mitochondria aktiwiteet fon CD4 + T-kleewer (MitoTracker tunkel roote) (B) Representatiiwe xpiichelcher (links) un tabulatsioons xpiichelcher (rechts), CD8 + T-kleewer un EpCAM + T-kleewer un EpCAM + T-kleewer a. (C) Te ferklaychung fon CD4 + un CD8 + xëlcher (fon CD3 + T xëlcher) in ascite un tumor. (D) Proportsioon fon EpCAM + tumor xëlcher in ascite un tumore (CD45−). (E un F) EpCAM + CD45-tumor un EpCAM-CD45-matrix glukoos uf nëmung (2-NBDG) (E) un mitochondriale aktiwiteete (MitoTracker tunkel roote) (F) representatiif xpiichelcher (links) un tabulatsioons xpiichelcher ( Rechts) Ascite un tumor seele. (G) Representatiiwe xpiichle fon CD25, CD137 un PD1 ausxprechung torich flus tsitometrii. (H un I) CD25, CD137 un PD1 ausxprechunge uf CD4 + T-kleewer (H) un CD8 + T-kleewer (I). (J un K) Naif, sentral memorii (Tcm), efektoor (Teff) un efektoor memorii (Tem) fenomeene woo uf te ekspresioon fon CCR7 un CD45RO basiert sin. Representatiiwe pilter (links) un tabulaare data (rechts) fon CD4 + T-kleewer (J) un CD8 + T-kleewer (K) in ascite un tumore. P-werte sin pextimt torich t-test (*P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001). Ti linyen representiire ti kexprochne patiënte (n = 6). FMO, fluoresëns minus een; MFI, intensiteet fon te fluoresëns.
Witer analyse hot anere importante unerxiite tswixe te hooch resolutsioon fon te T-kleewer fenomeen status ketsaycht. Ti aktiwiteet (Figura 1, G pis I) un efektoor memorii (Figura 1, J un K) in te tumore sin fiil mee uf kehoop wii ti ascite (proportsioon fon CD3 + T-kleewer). Tas selwiche, ti analyse fon te fenomeen torich ti ausxprechung fon aktiwiteet marker (CD25 un CD137) un ferxwinungs marker [prokram fon te xël toot protuktsioon 1 (PD1)] hot ketsaycht tas, opwool ti metaalixe karakteristike fon tëne populatsioone unerxiitliche sin (Figura S1, B pis E) , Awer khee signifikante metaalixe unerxiite tswixe memoore ore S1. F pis I). Ti resultaate sin konfirmiert kep torich ti penutsung fon maschine lërne methoote fer ti automatix xprooch fon te mënxe se xraywe (21), was noch mee ti presëns fon en kroos numer fon knochen marke (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) in te patiënt sayn ascite ketsaycht hot (Figura S2A ). Uf ale identifitseerte xël sorte, hot tiise myeloid xël populatsioon ti heechste glukoose uf nëmung un mitochondrial aktiwiteet ketsaycht (Figura S2, B pis G). Ti resultaate tsayche ti xtarke metaalixe unerxiite tswixe te multiplitseyert xëlwer sorte woo in ascite un tumore in HGSC patiënte kefun kewe.
Ti haupst ausfilung fer ti metaalixe kharakteristike fon te TIL se ferxteen is ti neetichkheet fer T-kleewer protukte fon kenuuch raynheet, kwaliteet un kwantiteet fon te tumore isoleere. Rexënt xtuutium hot ketsaycht tas ti sorteere un peruuf methoote woo uf te flus tsitometrii basiert sin, khëne ferënerunge in te xëlwer metaalixe profiile pringe (22-24). Fer tas propleem se iwerwinere, hon mer ti peruuf ferpintungs methook optimiseyert fer ti TIL fon te chirurxii resektsioon fon te mënxliche oowe kanser isoleere un isoleere, foer te analyse torich LC-MS/MS (siin Materiais e Métodos; Fikuur 2A). Um ti kans impak fon tëm protokol uf ti metaalixe ënerunge pehantele, hon mer ti metaalixe profiile fon te T-kleewer woo fon te kesuntheet fon te mënxe aktiwiert kep sin noo tëm oowe xrit noo te peruuf separatsioon mit te xëlcher woo net peruuf separatsioon waare, awer woo uf em eyerxt plats keplip sin, ferklaycht. Ti kwaliteet kontrol analyse hot ketsaycht tas es en hooche korrelatsioon tswixe tëne tswaay kontitsioone kept (r = 0,77), un ti teknixe repetitsioons kapasiteet fon te krupe fon 86 metaale hot en hooche repetitsioons kapasiteet (Figura 2B). Tesweche, khëne tiise methoote ti akkuraat metaalixe analyse in te xëlcher woo ti xëlcher tiwersiteet uner xtele, soo ti eyerxt hooch resolutsioons plats fer ti identifikatsioon fon spetsiifixe metaalixe metaale in HGSC, was ti mënxe erlaupnis kept fer en tiif ferxtëntnis fon te xëlcher spetsiifisiteet Seksuaal metaboliismus prokram kriin.
(A) Schemaatixe diagram fon te magnetixe perle ferrichtung. Foer ti analyse torich LC-MS/MS, wëre ti xtele tray xrit noo heyer fon te magnetixe peruuf fertiint ore uf em eyer playwe. (B) Te efekt fon te ferkreesungs tiire uf ti kans metaalixe metaale. Te tswixe tsayt fon tray meechlichkheete fer yeete ferkreesungs tiire ± SE. Ti xtraus representiirt een 1:1 relatsioon. Ti intra-klaas korrektsioon (ICC) fon te repetitsioons meechlichkheete woo in te axëns etiket ketsaycht kept. NAD, nikotinamiid adenin dinukleotiid. (C) Schemaatixe diagram fon te aarwats xrit fon te patiënt metaal analyse. Ascites orer tumore wëre fon te kranke samer ketuun un kriopreserweyert. En kleene teel fon yeete protukt waar torich ti flus tsitometrii analysiert kep, wën ti restliche protukte tray xrit noo foran fer ti CD4+, CD8+ un CD45- xëlcher uner kenom hon. Tiise xël fraktsioone sin mit LC-MS/MS analysiert kep. (D) Heete karte fon standartisierte metaalixe abundans. Tas Dendrogram representeyert ti xprooch fon te euklixe xprooche tswixe protukte. (E) Prinsiiplich komponënt analyse (PCA) fon protukt metaal karte, woo tray replikatsioone fon yeete protukt tsaycht, protukte fon te selwiche patiënt sin torich en xtraal ferpun. (F) Te PCA fom metaal profiil fon te protuktsioons kontitsioone uf te patiënt (i.e., mit te penutsung fon teel redundans); te proop type is limitiert fon te konvexe rom. PC1, haupste komponënt 1; PC2, haupste komponënt 2.
Als neekst, hon mer tiise ferkreesungs methook penutst fer 99 metaale in te CD4 +, CD8 + un CD45-kleewer fraktsioone in te priimer ascite un tumore fon seks HGSC-patiënte analyseere (Fikuur 2C, Fikuur S3A un Tawel S3 un S4). Ti populatsioon fon interese macht 2% pis 70% fom orikinaal kroose protukt fon leewent xëlcher, un te proportsioon fon te xëlcher variiert fiil tswixe te patiënte. Noo tëm ti persoone sich aus naner kexnit hon, is ti fertiint fraktsioon fon te interese (CD4+, CD8+ ore CD45-) mee wii 85% fon ale leewente xëlcher in te protuktsioon im xtant. Tiise ferkreesungs methook erlaupt uns ti xëlwer populatsioone fon te mënxliche tumor tiskusioons metaboliismus analyseere, was fon kroose protukte unmeechlich is. Mit tëm protokol, hon mer fest kextelt tas l-kynurenine un adenosine, ti tswaay xprooche woo in te tumore T-kleewer ore tumore-kleewer erkhëne (Figura S3, B e C). Tesweche, tsayche ti resultaate ti fiilme un ti kapasiteet fon unser xëlwer separatsioon un mass spektrometrii teknolokii fer ti biolookix importante metaale in te patiënte tiskuse se fine.
Unser analyse hot aach en xtarek metaalixe separatsioon fon te xëlwer sorte in un tswixe ti patiënte ketsaycht (Figura 2D e Figura S4A). Im spetsiaale, im ferklaych mit anere patiënte, hot te patiënt 70 ferxiitne metaalixe kharakteristike ketsaycht (Figura 2E un Fikuur S4B), was tsaycht tas es en substansiaal metaalixe heterojeneiteet tswixe patiënte kept. Es is important se wise tas, im ferklaych mit anere patiënte (1,2 pis 2 liter; Tawel S1), ti kans numer fon ascites woo in te patiënt 70 (80 ml) kesammelt kep sin, kleener waar. Ti kontrol fon te inter-patiënte heterojeneiteet iwer ti haupste komponënte analyse (tsum payxpiil, mit te penutsung fon te partikulaare redundans analyse) tsaycht konsistens fer ti ënerunge tswixe te xëlcher sorte, un ti xëlwer sorte un/orer mikro-umwelt sin klaych agreweyert kep noo em metaalixe profiil (Figura 2F ). Ti analyse fon eensiche metaale hot tiise efekte pekhant kemach un hot importante unerxiite tswixe te xëlcher sorte un ti mikroklima ketsaycht. Es is important se wise tas te ekstreemste unerxiit woo ketsaycht kept, is MNA, woo normalerwayse in CD45- xëlcher ferpint kept un in CD4+ un CD8+ xëlcher woo te tumor infiltreere (Figura 3A). Fer ti CD4 + xëlcher, is tee efekt am mëyeste klaar, un te MNA in te CD8 + xëlcher khomt aach xtarek fon te umwelt petrof. Awer, tas is net important, wayl ploos tray fon te seks pasiënte khëne fer ti tumor CD8+ xpiichle evaluiert kewe. Neekst ti MNA, in te ferxiitne sorte fon xëlcher in te ascite un tumore, sin anere metaale woo xlecht kekhënt kewe in te TIL, aach tiferensiaal raych (Figuras S3 e S4). Tesweche, tuun tiise data en prominënt sets fon imunomodulatsioons metaale fer ti neekste forxunge tsayche.
(A) Normaal inhalt fon MNA in CD4+, CD8+ un CD45- xëlcher fon ascite un tumor. Ti khaste ploos tsaycht ti mediaan (liin), ti interkwartial reechle (raam xpanung) un ti data reechle, pis 1,5 mool te interkwartial reechle (raam whisker). Soo wii in te Patiënt Materiaale un Methode pexrip kept, penutst te lima-wert fon te patiënt fer ti P-wert se pewayse (*P<0,05 un **P<0,01). (B) Schemaatixe diagram fon te MNA-metabolismus (60). Metabolite: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosiin-1-homocistein; NA, nikotiin tas; MNA, 1-metilnikotinamiid; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamiid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamiid; NR, nikotinamiid riboos; NMN, een mononukleotiid nikotinamiid. Enzyme (kroos): NNMT, nikotinamiid N-metiltransferase; SIRT, een sirtuin; NAMPT, nikotinamiid fosforbosil transferas; AOX1, aldehyd oksidaas 1; NRK, nikotinamiid ribosiid kinase; NMNAT, nikotinamiid mono nukleotiid adenilat transferas; Pnp1, purin nukleosiid fosforilase. (C) t-SNE fon scRNA-seq fon ascite (xwayn) un tumor (root; n = 3 patiënte). (D) NNMT ausxprechung in unerxiitliche xël populatsioone woo mit scRNA-seq identifitsiert kep sin. (E) Ekspresioon fon NNMT un AOX1 in SK-OV-3, mënxliche ëmbrioone nier (HEK) 293T, T-kleewer un MNA-pehantelte T-kleewer. Ti falx ausxprechung is relatiif tsu SK-OV-3 ketsaycht kep. Ti ausxprechungs musterum mit SEM is ketsaycht kep (n = 6 kesunt xpiichler). Ct-werte woo mee wii 35 sin, sin als unkeweenlich (UD) aan kekukt. (F) Expresioon fon SLC22A1 un SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, T-kleewer un T-kleewer woo mit 8mM MNA pehantelt kep sin. Ti falx ausxprechung is relatiif tsu SK-OV-3 ketsaycht kep. Ti ausxprechungs musterum mit SEM is ketsaycht kep (n = 6 kesunt xpiichler). Ct-werte woo mee wii 35 sin, sin als unkeweenlich (UD) aan kekukt. (G) Xël MNA inhalt in aktiwiteet fon te kesuntheet fon te donor T-xël noo 72 xtune fon inkubatsioon mit MNA. Ti ausxprechungs musterum mit SEM is ketsaycht kep (n = 4 kesunt xpiichler).
MNA kept protutseert torich ti iwertragung fon te metil krupe fon S-Adenosiil-1-metionin (SAM) in nikotiin (NA) torich nikotiin N-metiltransferase (NNMT; Fikuur 3B). NNMT is iwer kexproch kep in en ferxiitne mënxliche kanser un is mit proliferatsioon, influëns un metastase ferpun (25-27). Fer ti xpringe fon MNA in T-kleewer in TME peser se ferxteen, hon mer scRNA-seq penutst fer ti ekspresioon fon NNMT iwer ti xëlcher sorte in te ascite un tumore fon tray HGSC-patiënte se karakteriseere (Taatel S5). Analyse fon unkefeyer 6.500 xëlcher hot ketsaycht tas in ascite un tumore umfeltung, ti NNMT ekspresioon fer ti presumptsioons fibroblaste un tumore xëlcher populatsioone pextimt kep waar (Figura 3, C e D). Es is important se wise tas es khee klaare NNMT ausxprechung kept in en populatsioon woo PTPRC (CD45 +) aus xprecht (Figura 3D un Fikuur S5A), was tsaycht tas te MNA woo im metaal spektrum kefun kept, in T-kleewer introtuseyert kep waar. Ti ekspresioon fon te alkohool oksidaas 1 (AOX1) tuut ti MNA in 1-metil-2-piritoon-5-karboksamiid (2-PYR) ore 1-metil-4-piridoon-5-karboksamiid (4-PYR) konwerteyere; Fikuur 3B) is aach fer ti populatsioon fon fiproniin woo COL1A1 aus xpreche (Fikuur S5A), woo tsusamer tsaycht tas ti T-kleewer ti kapasiteet fon te konwentsionaale MNA-metabolismus ferliire. Ti ekspresyoons musterum fon tëne MNA-relatsioone sin fersichert kep mit en tsweete unaafhängich xël data sets fon ascite fon HGSC-patiënte (Figura S5B; n = 6) (16). Tsum payxpiil, ti kwantitatiif polimerase ketrënk reaktsioon (qPCR) analyse fon kesunt T-kleewer woo mit MNA tratamënt kemacht kep sin, hot ketsaycht tas, im ferklaych mit te kontrol SK-OV-3 oower tumor seele, NNMT ore AOX1 neekst net aus kexproch kep waar (Figura 3E). Tiise unerxiitliche resultaate tsayche tas MNA khan fon fibroblaste orer tumore in ti neekste T-kleewer in TME aus kexproch wëre.
Opwool ti kanse kanditaate ti familye fon te organixe katione transporteere 1 pis 3 (OCT1, OCT2 un OCT3) inkluuwe, woo ti familye fon te xlisel 22 (SLC22 un SLC22A3) kotifiseere, sin ti potensiaale transporteere fon MNA noch net pextimt kep (28). QPCR fon mRNA fon kesunt donor T-kleewer hot niter xtele fon te ekspresioons niwele fon SLC22A1 awer net-detektiif niwele fon SLC22A2, was pekhant kemach hot tas es foer heyer in te literatuur kexrip kep waar (Figura 3F) (29). Im keeche teel, hot ti SK-OV-3 oowe tumor xël line hooche niwele fon te tswaay transporteere aus kexproch (Figura 3F).
Um ti meechlichkheet fon te T-kleewer ti kapasiteet hon fer auslëntixe MNA uf nëme, kewe kesunt T-kleewer 72 xtune in te prezëns fon unerxiitliche konsentratsioone fon MNA kultiweyert. In te absëns fon eksogene MNA, khan te xëlwer inhalt fon MNA net kefun kewe (Figura 3G). Awer, ti aktiwiteete fon te T-kleewer woo mit eksogene MNA pehantel kep sin, hon en dosis-afhanklich ferkreeserung fon te MNA-inhalt in te xëlcher ketsaycht, pis 6 mM MNA (Figura 3G). Tas resultaat tsaycht tas, opwool te niwel fon te transporteere ekspresioon un te manktem fon te haupste enzyme woo ferantwortlich sin fer te intratsëlular MNA metaboliismus, TIL khan noch MNA uf nëme.
Te spektrum fon metaalixe metaale in te T-kleewer fon te patiënte un in vitro MNA-apsorptsioons eksperimente ferkreese ti meechlichkheet tas ti kanse fiproniin fon te kans welt (CAF) MNA sekreteere un ti tumor-kleewer khan te fenomeen un funktsioon fon TIL rekulaariseere. Fer te efekt fon MNA uf ti T-kleewer se pewayse, kewe kesunt T-kleewer in vitro in te presëns ore absëns fon MNA aktiwiert, un sayn proliferatsioon un citokiine protuktsioon waare ewaliert kep. Noo 7 taache fon MNA in te hoochste dosis, waar ti populatsioons numer fon te mënxe moterlich kexnit kep, wën ti kraft in ale dosis kehal kep waar (Figura 4A). Tsum payxpiil, ti tratamënt fon eksogene MNA hot en ferkreeserung fon te protuktsioon fon CD4 + un CD8 + T-kleewer woo te tumor nekrose faktor-α (TNFα; Fikuur 4B) aus xpreche, ketsaycht. Im keeche teel, ti intratsëlular protuktsioon fon IFN-γ waar signifikant ferkreest in te CD4 + T-kleewer, awer net in te CD8 + T-kleewer, un es waar khee signifikante ënerung in te interleukin 2 (IL-2; Fikuur 4, C un D). Tesweche, hot te enzym-ferpintungs imunosorbent test (ELISA) fon te super-natante fon tëne MNA-pehantelte T-kleewer kultuure ketsaycht, en simpoolix ferkreesung fon te TNFα, en ferklaychung fon te IFN-γ, un khee ënerung fon te IL-2 (Figura 4, E pis G). . Ti ferklaychung fon IFN-γ tsaycht tas MNA en rol xpiile khan in te inhiweyerung fon te anti-tumor aktiwiteet fon T-kleewer. Um te efekt fon MNA uf ti T-kleewer-petaytung fon te citotoksisiteet simuliire, kewe ti chimeerixe antike reseptor T (FRα-CAR-T) xtele woo ti foleks reseptor α un CAR-T (GFP) xtele, woo fon te xëlcher fon te xëlwer fluoresëns protuktsioon (GFP) -CAR-T) xtele, woo fon te kesunt donor perifere pluut mononuus xëlcher PBMC) xëlcher protutseert kep. CAR-T-xëlcher waare 24 xtune in te presëns fon MNA kultiweyert kep, un tan sin se mit mënxliche SK-OV-3 oowe tumor xëlcher ko-kultiweyert kep, woo folaat reseptor α aus xpreche, in en efektor-tsiil fertiint fon 10:1. Ti MNA-tratamënt hot en sicher ferklaychung fon te tootliche aktiwiteete fon te FRα-CAR-T-seele ketsaycht, was ti FRα-CAR-T-seele woo mit adenosine tratamënt kemacht kep sin, ëkstra ferklayche (Figura 4H).
(A) Total leewens mitel xëlwer numer un populatsioons ferklaychung (PD) direktsioon fon te kultuur am taach 7. Te xtraal xtel representeyert te mittel + SEM fon seks kesunt xpiichler. Representeyert ti data fon mindestens n = 3 unaafhängiche eksperimente. (B pis D) CD3/CD28 un IL-2 sin penutst kep fer ti T-kleewer in sayn respektiiwe MNA-konsentratsioone fer 7 taache se aktiwiire. Foer te analyse, waare ti xëlcher mit PMA/Ionomycin mit GolgiStop fer 4 xtune stimuliert kep. TNFα (B) ausxprechung in T-kleewer. Eksëlëns pilt (links) un tabulaar data (rechts) fon TNFα ausxprechung in leewente xëlcher. IFN-γ (C) un IL-2 (D) ausxprechung in T-kleewer. Ti ausxprechung fon te citokiine waar torich ti flus citometrii kemeesert kep. Ti xtraal xtraal representeyert te mittel (n = 6 kesunt xtraal) + SEM. Ti eensichst analyse fon te warianse un repetitsioons meechlichkheete (*P<0,05 un **P<0,01) penutse fer te P-wert se pewayse. Representeyert ti data fon mindestens n = 3 unaafhängiche eksperimente. (E pis G) CD3/CD28 un IL-2 sin penutst kep fer ti T-kleewer in sayn respektiiwe MNA-konsentratsioone fer 7 taache se aktiwiire. Tas mittel waar foer un noo 4 xtune fon PMA/Ionomycin stimulatsioon kesammelt kep. Ti konsentratsioone fon TNFα (E), IFN-γ (F) un IL-2 (G) sin torich ELISA kemeesert kep. Ti xtraal xtraal representeyert te mittel (n = 5 kesunt xtraal) + SEM. P-wert pextimt mit te hilef fon een-wayl analyse fon te warianse un repetitsioons meechlichkheete (*P<0,05). Ti punktiirt xtraus tsaycht ti entfërnungs limit fon te entfërnung. (H) Test fon te xël lyse. FRα-CAR-T ore GFP-CAR-T xëlcher waare mit adenosiin (250μM) ore MNA (10 mM) fer 24 xtune kexnit kep, ore oone tratamënt kelos kep (Ctrl). Ti prosentxaft fon te toote fon SK-OV-3 xëlcher waar kemeesert kep. P-wert pextimt torich Welch t-test (*P<0,5 un **P<0,01).
Um en mechanistixe ferxtëntnis fon te MNA-afhanklich TNFα ekspresioons rekularisierung se kriin, sin ti ënerunge in te TNFα mRNA fon te MNA-pehantelte T-kleewer ewaliert kep (Figura 5A). Kesunt T-kleewer fon te donor woo mit MNA tratamënt kemacht kep sin, hon en tswaay-fache ferkreeserung fon te TNFα transkriptsioons niwele ketsaycht, was tsaycht tas MNA fon te TNFα transkriptsioons rekularisierung ap hëngt. Fer tiise meechlich rekulaar mechanisme unersuuche, sin tswaay pekhante transkriptsioons faktoore woo TNFα rekulaariseere, neekst ti aktiwiteet fon te T-kleewer nuklear faktor (NFAT) un te spetsiifixe protukt 1 (Sp1), evaluiert kep als antwort uf ti MNA-bindung an te proksimaal TNFα-promotor ( 30). Te TNFα-promotor hot 6 identifitseerte NFAT-petaytungs sites un 2 Sp1-petaytungs sites, woo sich iwerlaype uf en plats [-55 base paare (bp) fon te 5’cap] (30). Kromatiin imunopresipitatsioon (ChIP) hot ketsaycht tas wën se mit MNA tratamënt kemacht kep sin, ti ferpintung fon Sp1 mit em TNFα promotor sich tray mool ferkreest hot. Ti influëns fon te NFAT hot aach ti importans ferkreest un sich aankextrëngt (Figura 5B). Tiise data tsayche tas MNA ti ekspresioon fon TNFα torich Sp1 transkriptsioon rekularisiert, un in en kleener petaytung ti ekspresioon fon NFAT.
(A) Im ferklaych mit T-kleewer woo oone MNA kultiweyert kep sin, ti falx ënerung fon te TNFα ekspresioon in T-kleewer woo mit MNA pehantelt kep sin. Ti ausxprechungs musterum mit SEM is ketsaycht kep (n = 5 kesunt xpiichler). Representeyert ti data fon mindestens n = 3 unaafhängiche eksperimente. (B) Te TNFα-promotor fon T-kleewer woo mit ore oone 8 mM MNA noo NFAT un Sp1 pehantelt kep sin, waare mit (Ctrl) un PMA/ionomisin stimulatsioon fer 4 xtune kombiniirt kep. Imunoglobulin G (IgG) un H3 waare als neekste un positiife kontrole fer ti imunopresipitatsioon penutst kep, respektiwlich. Ti kwantifikatsioon fon ChIP hot ketsaycht tas ti ferpintung fon Sp1 un NFAT an te TNFα promotor in MNA-pehantelte xëlcher mee wii een mool kewakst hot im ferklaych mit te kontrol. Representeyert ti data fon mindestens n = 3 unaafhängiche eksperimente. P-wert pextimt torich meerere t-tests (*** P <0,01). (C) Im ferklaych mit te ascite fon HGSC, T-kleewer (net-citotoksixe) hon en ferkreest ekspresioon fon TNF im tumor ketsaycht. Ti farpe representiire unerxiitliche kranke. Ti ketsaychte xtele sin randomiseyert kep fer 300 un jittere fer ti iwerxprechung se limiteere (** Padj = 0,0076). (D) Propoos model fon MNA fer oowe kanser. MNA is in tumor xëlcher un fibroblaste in TME kemacht kep un is fon T xëlcher uf kenom kep. MNA ferkreest ti ferpintung fon Sp1 an te TNFα-promotor, was fer ti ferkreesung fon te TNFα-transkriptsioon un ti TNFα-citokiine protuktsioon pringt. MNA macht aach een ferklaychung fon IFN-γ. Inhiweyerung fon te T-kleewer funktsioon pringt tsu te xlechte tootliche kapasiteet un tsu te akseleratsioon fon te tumor wakstum.
Soo wii ti pekhante aus keleet hon, hot TNFα front un hiner-afhanklich anti-tumor un anti-tumor efekte, awer hot en pekhant rol in te promotsioon fon te wakstum un metastase fon te oowe kanser (31-33). Soo wii ti pekhantmachunge tsayche, is ti konsentraatsioon fon TNFα in te ascite un tumor tiskusioon fon te patiënte mit oowe kanser heecher wii tii in te xlechte tiskusioone (34-36). In te mechanisme, khan te TNFα ti aktiwiteet, ti funktsioon un ti proliferatsioon fon te wayse pluut seele rekulaariseere, un te fenomeen fon te kanser seele ënere (37, 38). Konsistent mit tëne entwiklunge, hot ti tiferensiaal xprooch ekspresioon analyse ketsaycht tas TNF signifikant uf kexpant kep waar in T-kleewer in tumor tiskuse ferklaycht mit ascites (Figura 5C). Ti ferkreesung fon te TNF ekspresioon waar ploos in te T-kleewer populatsioone mit en net-citotoksixe fenomeen (Figura S5A). In te resumatsioon, tiise data unerxtitse ti itee tas MNA tswaay imunosupresiif un tumor promotsioons efekte in HGSC hot.
Fluoresëns etikeete woo uf te flus tsitometrii basiert sin, sin ti haupst methote fer te TIL metabolismus xtuteere kep. Ti xtuutium hon ketsaycht tas, im ferklaych mit te perifere pluut lymfotsiite ore T-kleewer fon te sekuntaare lymfotsiite, ti TIL fon te murine un fon te mënxe en heecher tentëns hon fer ti glukoos uf nëme (4, 39) un te xrit noo xrit fer ti mitochondrial funktsioon se ferliire (19, 40). Opwool mer in tiise xtuutium soo sorte resultaate peopacht hon, is ti xlisel fer ti entwiklung fon te metaboliismus fon te tumor seele un TIL fon te selwiche resektsioons tumor tiskusioon ferklayche. Konsistent mit etliche fon tëne foerxritne pekhantmachunge, ti tumore (CD45-EpCAM +) xëlcher fon te ascite un tumore hon mee glukoos uf nëmung wii CD8 + un CD4 + T xëlcher, was unerxtitst tas ti hooch glukoos uf nëmung fon tumor xëlcher mit T xëlcher ferklaycht kewe khan. Te konsëpt fon T-kleewer konkurëns. TME tas. Awer, ti mitochondrial aktiwiteet fon te tumor xëlcher is heecher wii ti fon te CD8 + T xëlcher, awer ti mitochondrial aktiwiteet is ëkstra fer ti CD4 + T xëlcher. Ti resultaate ferxtërke tas uf xtayende theema tas te oksiijen metaboliismus important is fer ti tumor seele (41, 42). Tii saan aach tas ti CD8 + T-kleewer mee uf kexpant kewe khëne fer ti oksiijen ferpintunge wii ti CD4 + T-kleewer, ore tas ti CD4 + T-kleewer anere karbon kweele penutse khëne wii ti glukoos fer ti mitochondrial aktiwiteet hale (43, 44). Es sol ketsaycht kewe tas mer khee unerxiit in te glukoos uf nëmung ore mitochondrial aktiwiteet tswixe CD4 + T-efëktoore, T-efëktoore memorii un T sentral memorii seele in te ascites peopacht hon. Tas selwiche, te tiferensiatsioons xtel fon CD8 + T-kleewer in tumore hot niks se tuun mit te ënerunge in te glukoos uf nëmung, was te signifikante unerxiit tswixe T-kleewer in vitro kultiweyert un te mënxliche TIL in vivo petayte (22). Ti opserwayrunge sin aach konfirmiert kep torich te penutsung fon unerxiitliche automatixe xël populatsioons alokeerunge, was noch mool ketsaycht hot tas CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + xël mit heechste glukoos uf nëmung un mitochondrial aktiwiteet wii ti tumor xël sin, awer hon Metabolixe aktiif xël populatsioon. Tiise populatsioon khan ti putatiif unerxtitsung fon te myeloiter suppresores xëlcher ore plasmatsiit dendrite xëlcher representeere woo in te scRNA-seq analyse identifitseert kep sin. Opwool ti tswaay fon tëne in mënxliche oowe tumore kexproch kep sin [45] , prauche se noch wayter aarwat sin fer tiise myeloid subpopulatsioon se pexraywe.
Opwool ti flus tsitometrii-basierte methoote ti alte unerxiite in te glukoos un oksiijen metaboliismus tswixe te xëlwer sorte klaych fest xtele khëne, sin ti presëns fon te metaboliite woo fon te glukoos ore anere karbon kwel fer ti mitochondrial metaboliismus in TME noch net pextimt kep. Ti presëns ore absëns fon metaale fer en pextimte TIL-Subset aan kewe, ferlangt ti reinichung fon te xël populatsioon fon te ausxtëlungs tiskusioon. Tesweche, khan unser xël ferkreesungs methook kombineert mit mass spektrometrii insicht kewe in ti metaale woo tiferensiaal fertiint sin in T-xël un tumor xël populatsioone in te ferklaychung fon te patiënte protukte. Opwool tiise methook foerxritne hot iwer ti fluoresëns-aktiwiteet fon te xël sorteere, khëne ëtliche metaalixe biblioteeke petrof kewe weche inerlich stabiliteet un/orer xnël umsetsungs rate (22). Trokne layt, unser methook khont tswaay erkhënte imunosupresiwe metaale identifitseere, ti adenosine un ti kynurenine, wayl se fiil ferxiitne sin tswixe protuktsioons sorte.
Unser metaalixe analyse fon te tumore un TIL-subtipe kept mee insicht in ti rol fon te metaalixe in te oowe TME. Erste, mit te hilef fon te flus tsitometrii, hon mer kefun tas es khee unerxiit kept in te mitochondrial aktiwiteet tswixe tumore un CD4 + T-kleewer. Awer, ti LC-MS/MS analyse hot importante ënerunge in te kans welt ketsaycht, was petayt tas ti konklutsioone iwer te TIL metaalixe un sayn kanse metaalixe aktiwiteete soriche ferlange. Tsweetens, is te MNA te metaal woo te kreeste unerxiit tswixe CD45-kleewer un T-kleewer in te ascites hot, net in te tumore. Tesweche, khan ti kompartmënt un ti tumor positsioon unerxiitliche efekte uf te TIL metaboliismus hon, was ti meechlichkheet fon te heterojeneiteet in en pextimte mikroklima uf heepe. Tritens, ti ekspresioon fon te MNA-produtsiirente enzym NNMT is hauptseechlich fer CAF, woo ti tumor xëlcher in en kleener petaytung is, awer ti entfërnung fon te MNA niwele sin in te tumor-orikinaale T-xëlcher ketsaycht kep. Ti iwerxprechung fon NNMT in te oowe CAF hot en pekhant kanser-promotsioons efekt, teels weche te promotsioon fon CAF metaboliismus, tumor influëns un metastase (27). Opwool te kanse niwel fon TIL moterlich is, is ti ekspresioon fon NNMT in CAF ticht ferpint mit tëm Kanser Xenom Atlas (TCGA) mesenchymal subtipe, woo mit xlechte proknose ferpun kept (27, 46, 47). Tsum xlus, ti ekspresioon fom enzym AOX1 woo ferantwortlich is fer ti MNA-petaytung, is aach in te CAF-populatsioon limiteyert kep, was tsaycht tas ti T-kleewer ti kapasiteet hon fer MNA se metaboliiseere. Ti resultaate unerxtitse ti itee tas, opwool noch mee aarwat neetich is fer tiise entwiklung se ferxteen, hooche niwele fon MNA in te T-kleewer khan ti presëns fon en imunosupresiif CAF mikroklima tsayche.
Wën mer te nikle fon te ekspresyoons niwel fon MNA transporteere un ti unkeweenliche niwele fon te xlisel protukte woo in te MNA metaboliismus influëntsiert kewe, is ti presëns fon MNA in T-kleewer unerxiitliche. Weer NNMT ore AOX1 khont torich scRNA-seq analyse un qPCR fon tswaay unaafhängiche kohorte kefun kewe. Ti resultaate tsayche tas MNA net fon T-kleewer sintetisiert kept, awer fon umkefeyer TME apsorweyert kept. In vitro eksperimente tsayche tas ti T-kleewer tenke tas ti eksogene MNA sich samele.
Unser in vitro xtuutium hot ketsaycht tas ti eksogene MNA ti ekspresioon fon TNFα in T-kleewer influëntsiert un ti ferpintung fon Sp1 an te TNFα-promotor ferkreest. Opwool TNFα tswaay anti-tumor un anti-tumor funktsioone hot, in te oowe kanser, khan TNFα te wakstum fon oowe kanser promoweere (31-33). Ti neutralisatsioon fon TNFα in te oowe tumor xël kultuur ore ti eliminatsioon fon TNFα siinaal in muus modele khan ti TNFα-petaytung fon inflamtsioons citokiine protuktsioon ferpesere un te tumor wakstum inhiweyere (32, 35). Tesweche, in tëm kast, khan te TME-petaytungs MNA als pro-inflammatoor metaal funktsiooneere torich en TNFα-afhanklich mechanisme torich ti autokrine loop, was ti foerkhom un ferpraytung fon oowe kanser promoweyert (31). Basiert uf tee meechlichkheet, kept ti TNFα-Blokatsioon als potensial therapeutix aktiwiteet fer ti oowe kanser xtuteyert (37, 48, 49). Tsum payxpiil, MNA ferxlimert ti citotoksisiteet fon CAR-T-seele fer ti oowe tumor seele, was noch mee pewaysunge kept fer MNA-petaytungs imuniteet suppresioon. Kolektiif, tiise resultaate tsayche en modelo woo ti tumore un CAF-seele MNA in ekstraselulaare TME sekreteere. Tort (i) TNF-influëns stimulatsioon fon te wakstum fon te oowe kanser un (ii) MNA-influëns T-kleewer citotoksixe aktiwiteete inhiweyerung, khan tas en tswaayxproochichkheet hon (Figura 5D).
In te xlus, torich ti aan wënung fon en kombinatsioon fon xnël xël ferkreesung, eensichste xël sekwëns un metaalixe protuktsioon, hot ti xtuutium ti kroose imunometabolomixe unerxiite tswixe tumore un ascites xël in HGSC patiënte ketsaycht. Tiise umfasent analyse hot ketsaycht tas es unerxiite kept in te glukoos uf nëmung un mitochondriale aktiwiteete tswixe T-kleewer, un hot MNA als net-kleewer autonoome imuniteet rekulaar metaboliit identifitseert. Tiise data hon en influëns iwer wii ti TME te metabolismus fon te T-kleewer in te mënxliche kanser petreft. Opwool ti direkte konkurëns fer ti nutriente tswixe T-kleewer un kanser-kleewer kexproch kept, khëne ti metaboliite aach als inerlich rekulaarer funktsiooneere fer ti tumor protuktsioon se promoweere un eventuaal ti endogene imuniteet antworte uner xtele. Ti weitere pexprechung fon te funktsioons rol fon tëne rekulaare metaale khan alternatiife strateejie uf mache fer ti anti-tumor imuniteet antwort ferxtërke.
Patiënt protukte un klinixe data sin torich tas BC-Krankheits Tiskusioons Repositoorium fon te Kanata Tiskusioons Repositoorium Network zertifiseyert kep. Soo wii te protokol woo fom BC Kanser Forxungs Etika Komitee un ti Uniwersiteet fon Britixe Kolumbia (H07-00463) erlaupnis kep hot, hon ale patiënte sayn protukte un klinixe data ti influëns fon te xriftliche erlaupnis kriit ore formeel sayn erlaupnis ap kelos. Ti protukte sin in te zertifiseyert BioBank (BRC-00290) kexpaart kep. Ti detaillierte patiënte sin in te Tawel S1 un S5 ketsaycht kep. Fer ti kriopreserweerung, kept en xpits puup penutst fer ti tumor protuktsioon fon te patiënt mechanix ap xmayse un tan torich en 100 mikron filter xpuke fer en eensichst xël suspensioon se kriin. Ti ascite fon te patiënt waare mit 1500 rpm fer 10 minute in 4°C sentrifukiert kep fer ti xlisel se pelaytiche un te super-natant raus hoole. Ti xëlcher woo fon te tumor un ascite kriit kep sin, sin in 50% fon te hërte inaktiweyert mënxliche AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% fon te RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) un 10% fon te dimetil sulfoxiit kriyopreserweyert kep. Tiise preserweyert eensichste xël suspensioon waar aus ketaylt kep un is penutst kep fer ti metaalixe un metaalixe petaytunge woo too uner pexrip sin.
Tas kanse mittel is fon 0,22 μm filter 50:50 erkhënung fon RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) erfiilt mit 10% hits-inaktiwiert mënxliche AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) Streptomicin (PenStrep) lësung (Termofisher Wërter) un 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) is mit 20 mM Hepes (Termo Fixer Wërter) un 2 mM l-glutamin (Termo Fixer Wërter) erfiilt kep. Ti farwe fon te flus tsitometer waare fon 0,22 μm filter fon fosfaat puf (PBS; Invitrogen) kemacht kep, woo mit 3% hits-inaktiwiert AB mënxliche serum (Sigma) erfiilt kep waar. Ti xël ferkreesungs puch is fon 0,22μm filter PBS komponiert kep un is mit 0,5% hits-inaktiwiert mënxliche AB-serum (Sigma-Aldrich) erfiilt kep.
In 37°C komplet mittel, waare ti xliselcher mit 10 nM MT DR un 100 μM 2-NBDG fer 30 minute kefërept kep. Als neekst, waare ti xlisel mit te leewens mitel farwe eF506 in 4°C fer 15 minute kefërept kep. Ti xlisel sin in FC Bloco (eBiosciência) un Briljante Fleche Puffer (BD Biosciência) noch mool suspentiert kep, in te xlisel fon te xlisel fon te xlisel (noo ti instrutsioone fom fabrikant), un 10 minute in te kamare temperatuur inkexpërt kewe. Ti xlisel mit en set fon antikörpere (Taatel S2) in te flus tsitometrii farwe puffer uf 4°C fer 20 minute. Ti xlisel fon te xlisel fon te xlisel fon te xlisel fon te xlisel fon te xlisel (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsioon) foer te analyse. SpectroFlo un FlowJo V10 penutse fer ti xprooch fon te xtet analyseere, un penuts GraphPad Prism 8 fer ti xprooch se xraywe. Ti mediaan fluoresëns intensiteet (MFI) fon 2-NBDG un MT DR waar loch-normaal, un tan is en paar t-test penutst kep fer ti statistix analyse fer ti kexprochne patiënte se rexpekteere. Al ti populatsioone mit weenicher wii 40 ewënte fon te analyse wëch xafe; en MFI-wert fon 1 fer yeete neekste weyert in xraywe, eep ti statistik analyse un ti data visualisatsioon aus fiire.
Um ti manual gating strateejii fom oowe protses panel erkhëne, hon mer ti kans anotatsioon fon te form restriktsioons paam (FAUST) (21) penutst fer ti xlisel automatix fer ti populatsioon se xtele noo tëm ti toote xlisel in FlowJo eliminatsioon kemach kep sin. Meyer rechiire ti ausxtëlung manuel fer ti populatsioone woo ferkheert aus kexproch kep sin (PD1+ mit PD1-tumor xëlcher kombineere) un ti populatsioone woo kehal kep sin, fersamle. Yeete protukt hot im kansem mee wii 2% fon te mënxe, fer en kans 11 populatsioone.
Fikol xtraal tichtkheet sentrifugatsioon is penutst kep fer PBMC fon te leukotsiite separatsioon protukte (STEMCELL Teknolokii) se xpaare. CD8 + T-kleewer sin fon PBMC isoliert kep mit CD8 Mikro-Plats (Miltenyi) un sin in komplete mittel mit TransAct (Miltenyi) fer 2 woche aus keproch kep noo te instrutsioone fom fabrikant. Ti xtele waare 5 taache in en komplete mittel woo IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) enthalung hat, kelos kep, un tan sin se noch mool mit TransAct stimuliert kep. Am taach 7, noo te instrutsioone fom fabrikant, sin ti mënxliche CD45 MicroBeads (Miltenyi) penutst kep fer ti xëlcher in tray nookhomer runde ferpësere. Ti xtele waare fer ti flus tsitometrii analyse kexnit kep (wii xon foer heyer pexrip kep waar), un een milioon xtele waare tray mool fer ti LC-MS/MS analyse kexnit kep. Ti protukte sin torich LC-MS/MS ferprayt kep wii es uner kexrip kept. Meyer hon ti ferxwunene metaale weyert mit en ioon numer fon 1.000 pextimt. Yeete protukt kept normaliseyert torich ti kans ioon numer (TIC), logaritmix konwerteyert un automatix in MetaboAnalystR foer te analyse normaliseyert.
Ti eensichst xël suspensioon fon yeete patiënt waar aus kexnit kep un torich en 40 μm filter in komplete mittel kefilt kep (wii xon foer heyer pexrip kep waar). Soo wii te protokol fom fabrikant saat, sin tray nookhomer runde fon positiife selektsioon torich ti magnetixe peruuf separatsioon mit te hilef fon MicroBeads (Miltenyi) penutst kep fer ti protuktsioon fon protukte fer CD8+, CD4+ un CD45- xëlcher (auf eyerxt) fertiine. Kurt, ti xëlcher wëre in te xëlcher fertiint puch (wii xon foer heyer pexrip) un ketseelt. Ti xëlcher waare mit mënxliche CD8-perle, mënxliche CD4-perle ore mënxliche CD45-perle (Miltenyi) in 4°C fer 15 minute inkexpërt kep, un tan sin se mit xëlcher fertiint puffer kewaxt kep. Ti protuktsioon kept torich ti LS-Kolone (Miltenyi) kenom, un ti positiife un negatiiwe fraktsioone sin kesammelt kep. Fer ti tsayt se xmayse un te xrit noo te xëlwer rekuperatsioon maximiire, kept ti CD8-fraktsioon tan penutst fer ti tsweet xrit fon te CD4+-fertiinung, un ti CD4-fraktsioon fer ti neekste CD45-fertiinung. Hal ti lësung uf em eyerxt plats torich te kanse separatsioons protses.
Fer ti protuktsioon fon protukte fer ti metaalixe analyse foer perayte, kewe ti xliselcher een mool mit eyerxt sals lose kewaxt, un 1 ml 80% metaan in yeete protukt kexmis kep, tan vortex un snap kefërept kep in flëxich xtik fii. Ti protukte sin in tray friilings tsayte kexnit kep un sin mit 14.000 rpm fer 15 minute in 4°C sentrifukiert kep. Te super-natant woo ti metaale enthalung hot, wërt ferpint pis se trokne sin. Ti metaalixe metaale sin noch mool in 50 μl fon 0,03% xwayn foer kexlaa kep, vortex kexmis kep fer se mixe, un tan sin se sentrifukiert kep fer ti xlisel wëch xafe.
Extrait metaalixe wii xon pexrip. Transferir te super-natant in en hooch preserweerungs fëchelcher fer ti metabolomik forxung. Tuu een randomiseyert tratamënt protokol penutse fer yeete protukt mit en sëlwich numer fon xëlcher se trataare, tas ti xtek efekte ferhëngert kewe. Meyer hon en kwalitatiif petaytung fon te welt metaale kemacht, woo foer heyer puplitseyert kep waar uf em AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spektrometer (50). Chromatograafixe ​​analyse un intekratsioon fon te xpitse fon te xpitse sin mit te hilef fon te MultiQuant wersioon 2.1 (Aplicados Biosistemas SCIEX) kemacht kep.
En ioon xtel fon 1000 waar penutst kep fer ti ferkangheet fon te metaalixe weyert se xtime, un te TIC fon yeete protukt waar penutst kep fer ti normaale petaytung fon yeete protukt woo kefun kep waar, fer ti ënerunge woo ti instrumentaal analyse fon te protuktsioons protses introtuseyert hon, se korrekteere. Noch noo tëm TIC normaliseyert kep is, kept te MetaboAnalystR(51) penutst fer ti logaritmix konwersatsioon un ti automatix norm linie skaleere. Meyer hon PCA mit vegane R pakeet penutst fer ti eksploratsioons analyse fon te metaale unerxiite tswixe protuktsioons tiire, un hon ti teel redundans analyse penutst fer ti patiënte analyseere. Ti Ward-Methode penutse fer en hits khaart dendrogram konstruiire fer ti euklixe xtreet tswixe protukte se xtele. Meyer hon limma (52) iwer ti standartisierung fon te metaale penutst fer ti tiferensiaal metaale iwer ti kans xël tip un mikroklima identifitseere. Fer ti erkhënung se ferklayche, penutse mer te krupe mittel parameter fer te modelo se pexraywe, un ti xprooch tiire in te mikroklima als yeete krupe (n = 6 krupe); fer te petaytungs test, hon mer tray repetitsioons meechlichkheete fer yeete metaal kemacht Fer ti falx replikatsioon se fermixe, waar te patiënt als hiinkepung in te limma-entwicklung inkexrip kep. Fer ti unerxiite in te metaalixe metaale tswixe te ferxiitne patiënte se kontroliire, hon mer te lima model inkexrip in en fest aat. Meyer xpreche iwer ti petaytung fon te foerxritne kontraste tswixe te xëlwer tiwersiteet un te mikroklima fon Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg korrektsioon).
Noch noo ti kraft ferkreesung mit te penutsung fon Miltenyi Toote Xël Entfernungs Kit (>80% leewens mitel), is ti sekwëns fon eensichste xël transkriptoome uf te kans leewent ferfluucht ascite un tumor protukte mit en 10x 5′-gene ekspresioon protokol kemacht kep. Fiif kefale mit te selwiche tumore un ascites sin analysiert kep, opwool ti nikle fon te leewens mitel fon en tumor protukt sayn inklutsioon ferpoot hot. Um meerere selektsioone fon patiënte se erkhëne, hon mer ti protuktsioon fon yeete patiënt in te xtroose fon te 10x xprooch kontroliert, un ti ascite un tumor sites separat analysiert. Noch noo te sekwëns [Ilumina HiSeq 4000 28×98 bp paar ën (PE), Quebec kenom; in te mite fon 73.488 un 41.378 leese pro xël fer tumor un ascite respektiif]], hon mer CellSNP un Vireo (53) penutst (basiert uf CellSNP wii Te kewoonliche mënxliche SNP (VCF) woo fon GRCh38 foer kexlaa kept, is en xënker itentiteet fon GRCh38 kexikt kep. (IBS), ausxlus fon net-kexlosne xëlcher un xëlcher woo als duplexe identifitseert kep sin un ti antwort fon te xëlcher tswixe ascite un tumor protukte (54), hon mer tray kefale mit fiile xëlcher representatsioon in te tumor un ascite fer ti analyse noo runer kehal (ScCoran pa5)6. 6975 xëlcher (2792 un 4183 xëlcher fon tumor un ascites, respektiif) fer ti analyse, hon mer ti igraph (57) Louvain-Kluster fon te Ketaylt Neekst Nachparxlayt (SNN) basiert uf te Jaccard-Tistans fer ti kluster xëlcher torich ausxprechung fon te xëlcher woo manuel kexrip kep sin. un visualisiert mit t-SNE, sin tifiniert torich ti ekspresioon fon CD8A un GZMA, ausxlus fon te subkluster mit niter xtele fon te ribosome protuktsioon Meyer hon ti puplitseyert data fon Izar et al (16), tepay sayn t-SNE influëns, kontroliire ti ekspresioons marker tswixe imuniteet.
PBMC waare fon te leukotsiite separatsioons protukte (STEMCELL Teknolokii) torich Ficoll xtraal tichtkheet sentrifugatsioon ap kexnit kep. CD3 + xëlcher sin fon PBMC isoliert kep mit CD3 perle (Miltenyi). In te presëns ore absëns fon MNA, waare ti CD3+ xëlcher aktiwiert kep mit CD3 (5 μg/ml), CD28 (3 μg/ml) un IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Am letste taach fon te ekspansioon, waare ti leewens mitel (Fixable Leewens Mitel Farwe eFluor450, eBiosciência) un ti proliferatsioon (123% fon ePeere, Thermo Fisher Siëns) torich ti flus tsitometrii evaluiert kep. Evaluatsioon fon te efektoor funktsioon torich stimulatsioon fon te xëlwer mit PMA (20 ng/ml) un ionomycin (1 μg/ml) mit GolgiStop fer 4 xtune, un monitoore fon te CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) (Mab11, BD). Stimuleere qPCR un ChIP xëlcher mit PMA (20 ng/ml) un ionomisin (1 μg/ml) fer 4 xtune. Te ELISA-Supernatant waar foer un noo te stimulatsioon mit PMA (20 ng/ml) un ionomisin (1 μg/ml) fer 4 xtune kesammelt kep.
Fol mit te protokol fon te fabrikant fer ti RNA isoliire mit RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Nutz te QIA-Xraywer (QIAGEN) fer ti proof homogeniseere. Tuu khanst een hooch kapasiteet fon RNA fer cDNA penutse (Thermo Fisher Scientific) fer komplët DNA (cDNA) se sintetiseere. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) penutse fer ti xprooch fon te mënxe se kwantifitseere (noo em protokol fon te fabrikant) mit te folëkse xprooche: Hs02786624_g1 [gliseraldehyde-3-fosfat aus waserstof (GAPDH)] un Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ti protuktsioons protukte sin uf em StepOnePlus real-taim PCR-System (Aplicados Biosistemas) (Aplicados Biosistemas) in te MicroAmp xnël optixe 96-xtraal reaktsioons plats (Aplicados Biosistemas) mit MicroAmp optixe film kexpiilt kep. Yeete Ct-wert woo mee wii 35 is, kept als iwer ti entfërnungs xpiichel aan kesiin un is als unerxtitsungs xpiichel markiert kep.
ChIP aus fiire wii foer heyer pexrip (58). Kurt, ti xlisel waar mit formaldehyt (final konsentratsioon 1,42%) kexnit kep un 10 minute in te kamare temperatuur inkexpërt kep. Ti erkhënung fon te xwayn puch (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl un 0,1% NP-40) uf em eyerxt plats fer 10 minute, tan in imunopresipitatsioons puch, wii es pexrip kept (58 ). Ti protuktsioon is tan mit te foleke fon te xprooch kexproch kep: 10 xprooche (20 1-sekunte pulse) un en statixe tsayt fon 40 sekunte. Inkubeere ti antikörpere fon te ChIP-klas imunoglobulin G (Technologia de Signação de Células; 1 μl), histoon H3 (Tecnologia de Células de Signação; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) un SP1 (Technologia de Célulação de Signação; 3 μl) mit te protuktsioons xpiirung fon te protuktsioons mitel. Inkuweere ti protuktsioon fon proote A-perle (Thermo Fisher Scientific) mit te protuktsioons mitel uf 4°C mit 1 xtun lang, tan penutse ti protuktsioon fon te protuktsioons mitel (Bio-Rad) fer tas DNA fertiine, un penutse ti protuktsioon fon proote K (Thermo Fisher) fer ti protuktsioon fon proote. TNFα-promotor is door PCR detectet: foran, GGG TAT CCT TGA TGT TGT; im keeche teel, GTG CCA ACA AKT GCC TTT ATA TG (produkto de 207 pb). Ti pilter sin fon te Image Lab (Bio-Rad) kemacht kep un sin mit te hilef fon te Software ImageJ kwantifitseert kep.
Ti xël kultuur supernatant waar kesammelt kep wii es foer heyer pexrip kep waar. Ti pextimung is noo te protses fon te fabrikant kemacht kep, woo ti mënxliche TNFα ELISA-kit (Invitrogen), ti IL-2 ELISA-Kit (Invitrogen) un ti IFN-γ ELISA-Kit (Abcam) kemacht hon. Soo wii te protokol fom fabrikant saat, waar te super-natant 1:100 fertiint kep fer TNFα un IL-2 se fine, un 1:3 fer IFN-γ se fine. En Vision 2104 Multi-Label Leeser (PerkinElmer) penutse fer ti apsorptsioon fon 450 nm se meese.
PBMC waare fon te leukotsiite separatsioons protukte (STEMCELL Teknolokii) torich Ficoll xtraal tichtkheet sentrifugatsioon ap kexnit kep. CD3 + xëlcher sin fon PBMC isoliert kep mit CD3 perle (Miltenyi). In te presëns ore absëns fon MNA, waare ti CD3+ xëlcher mit plats kexnit kep fer CD3 (5 μg/ml), CD28 (3 μg/ml) un IL-2 (300 U/ml; Proleukin) fer 3 taache. Noo 3 taache, sin ti xlisel kesammelt kep un mit 0,9% salsich waser kewaxt kep, un ti peloonung is snap kefërept kep. Ti xëlcher sin torich ti xlisel fon te xprooch kexproch kep (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsioon) mit 123 xprooche ePerle.
Extrait metaalixe wii xon pexrip. Te trokne ekstrakt is in en konsentratsioon fon 4000 xëlwer ëkwiwalënte/μl rekonstituiert kep. Analyse fon te protuktsioon torich ti xprooch fon te xtet woo ti xtet uf kenom hon, torich ti xprooch fon te mënxe woo in te xtet woone, un ti xprooch fon te mënxe woo in te xtet woone, 2,1×150 mm, 1,6-μm partikel, 120-Å; #186008500). Polaar mass spektrometer (6470, Agilent), in was fer ëlektrix xprits ionisatsioon in positiif modus operiert. Ti mobiil phase A is 0,1% fom xwayn (in H2O), ti mobiil phase B is 90% fom asetonitril, 0,1% fom xwayn. Te LC-Xtraal is 0 pis 2 minute fer 100% A, 2 pis 7,1 minute fer 99% B, un 7,1 pis 8 minute fer 99% B. Tan, tuut ti kholone mit te mobiil phase A noch mool ëkwilibreere mit en xtraal rate fon 0,6 ml/min fer 3 minute. . Ti fliis is 0,4ml/min, un ti kholonne khamera is pis 50°C keheert kep. Ti pure kemiitlich norm fon te MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Nort York, Ontario, Kanata) penutse fer ti retentsioons tsayt (RT) un ti transformatsioon (RT = 0,882 minute, transformatsioon 1 = 137→94,1, transformatsioon 2 = 137, transformatsioon →373). Wën ale tray iwerxritunge in te richtich tsayt paseere, kept ti iwerxrit 1 penutst fer ti kwantifikatsioon se sicher lose, fer ti spetsiifisiteet se sicher lose. Ti standart kurwe fon MNA (Toronto Forxungs Chemixe Kompanii) is fon seks serie fertiinung fon te xtok lose (1 mg/ml) kexrip kep, fer ti standart fon 0,1, 1,0, 10 un 100 ng/ml un 1,0 un 10μg/ml respektiif fliisich se kriin. Ti entfërnungs xpiichel is 1 ng/ml, un ti lineer antwort is tswixe 10 ng/ml un 10μg/ml. Yeete injektsioon fon tswaay mikroliter protuktsioon un standart kept fer ti LC/MS analyse penutst, un en mixe fon kwaliteet kontrol protuktsioon kept yeete acht injektsioone aus kefiert, fer ti stabiliteet fon te analyse platform se sicher lose. Ti MNA-antworte fon ale MNA-pehantelte xël protukte waare in te lineare xpiichel fon te assay. Ti analyse fon te data is kemacht kep mit te hilef fon te Software MassHunter (v9.0, Agilent).
Ti tsweet jeneratsioon fon αFR-CAR konstruktsioon is fon Song et al. (59). Kurt, te konstrukt enthëlt ti folëkse inhalte: CD8a leerer sekwëns, mënxliche αFR-spetsiifixe eensichste ketrënke variatsioons fraktsioone, CD8a xpanung un transmembraan rechioon, CD27 intratsëlulaar domain un CD3z intratsëlulaar domain. Ti komplete CAR-Sekwëns is fon GenScript sintetisiert kep, un tan is se in te tsweete jeneratsioon fon te lentivirus ekspresioons vektor uf em weech fon te GFP-Expresioons Kasete klooniert kep, woo penutst kep waar fer ti transtuktsioon efisiëns ewalyeere.
Lentivirus is kemacht kep torich ti transfusioon fon HEK293T-xpiichle [Amerikaanixe Tip Kultur Kolëktsioon (ATCC); in Dulbecco sayn motiweyert Eagle-Medium kewakst, woo 10% fetaal rints serum (FBS) un 1% PenStrep enthalung hot, un hot CAR-GFP-Wektor penutst un Ti ferpachungs plasmide (psPAX2 un pMD2.G, Addgene) penutse ti lipofektsioons amin (Sigma-Aldrich). Te virus-entwicklungs super-natant waar 48 un 72 xtune noo te transfusioon kesammelt kep, kefilt kep un torich ultrasentrifugatsioon konsentreyert kep. Ti konsentreyert viral super-natant in -80°C pis ti transfutsyoon xpaare.
PBMC sin fon te kesunt xpiichle fon te leukotsiite xpiichle (STEMCELL Teknolokii) torich Ficoll xpiichle tichtkheet sentrifugatsioon. Ti positiife selektsioon fon CD8 mikrokrope (Miltenyi) penutse fer CD8+ xëlcher fon PBMC isoliire. Stimuleere ti T-kleewer mit TransAct (Miltenyi) un in TexMACS-Medium [Miltenyi; erfiilt mit 3% hërte-inaktiwierte mënxliche serum, 1% PenStrep un IL-2 (300 U/ml)]. Vier un tswansich xtune noo te stimulatsioon, sin ti T-kleewer mit lentivirus transtutsiert kep (10 μl konsentreyert virus supernatant pro 106 xëlcher). 1 pis 3 taache noo te transtuktsioon uf Cytek Aurora (auf FSC (Forte Xtreet)/SSC (Siit Xtreet), Singlet, GFP+), ti GFP-Expresioon fon te Xëlcher ewalyeere fer en transtuktsioon efisiëns fon mindestens 30% tsayche .
CAR-T-Xele sin 24 xtune lang in Immunokultura (STEMCELL Teknolokii; mit 1% PenStrep) keplanst kep uner te folëkse kontitsioone: net tratamënt, mit 250 μM adenosin ore 10 mM MNA tratamënt. Noch noo te foerxrit, sin ti CAR-T-Xele mit PBS kewaxt kep un mit 20.000 SK-OV-3-Xele [ATCC; in McCoy 5A-Medium (Sigma-Aldrich) erfiilt mit 10% FBS un 1% PenStrep uf 10: Te efektoor fer ti xpiichle fon 1 waar in triple in erfiilt Immunokult-Medium ferkreest kep. SK-OV-3 xëlcher un SK-OV-3 xëlcher woo mit 0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) kexnit kep sin, waare als neekste un positiife kontrole penutst kep, respektiwlich. Noo 24 xtune ko-kultiweyert, is te super-natant kesammelt kep un ti laktat-dehydrogenase (LDH) is noo te instrutsioone fom fabrikant kemeesert kep (LDH Glo Citotoksisiteet Assay Kit, Promega). Te LDH-supernatant waar 1:50 in LDH-puffer fertiint. Ti prosentxaft fon te toote is mit te folëkse formule kemeesert kep: prosentxaft fon te toote = prosentxaft fon te korrektsioon / maximaal tootliche rate x 100%, woo prosentxaft fon te korrektsioon = ko-kultuur-T-kleewer ploos, un maximaal toote rate = positiif kontrol-negatiif kontrol.
Soo wii in te tëkst orer in te materiaale un methoote pexrip kept, penuts ti xprooch fon te layt woo in te xtet woone, penutse fer ti xprooch fon te layt se xpreche. Wën meerere protukte fon te selwich patiënt samer ketuun kewe (wii ascites un tumor), penutse mer en paar t-test ore te patiënt als randomiseyert efekt in en lineaar ore generaliseyert model inkexrip, wii es neetich is. Fer ti metaalixe analyse, kept te importans testitsioon in triplikatsioon kemacht.
Fer ti erkhënung fon te materiaale fer tiise artikel, klikt uf te sayt fon te xprooch fon te layt:
Tas is en oone akses artikel woo ferprayt kept uner te pextimte reechle fon te Creative Commons Attribution-Non-Comercial License, woo ti penutsung, ferpraytung un reprotuktsioon in yeete mitel erlaupnis kept, soo lang wii ti ëntxlus net fer komersiaale nutse is un ti premisa is tas ti orikinaal aarwat richtich is. Referëns.
Nootwëntich: Mëyer ferlange ploos tas tuu tayn e-mail adres këpst, tas ti persoon woos tuu ti site recomendast, wees tas tuu wilst tas tii ti e-mail siin un tas es nët spam is. Meyer tuun khee e-mail adresse fange.
Tiise frooch wërt penutst fer se proope ops tuu een pesuucher pist un fer ti automatix spam se ferhëngert.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (russel g. jones), phineas t.
MNA macht mit fer ti imuniteet fon te T-kleewer un representeyert en potensial imunoterapii tsiil fer ti tratamënt fon mënxliche kanser.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (russel g. jones), phineas t.
MNA macht mit fer ti imuniteet fon te T-kleewer un representeyert en potensial imunoterapii tsiil fer ti tratamënt fon mënxliche kanser.
©2021 Amerikanixe Assosiatsioon fer ti Forterung fon te Wërter. ale rechte sin reserwiirt. AAAS is a partner of HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef and COUNTER. ISSN 2375-2548.