Protein sorteere in te sekreteere weech is essentiel fer ti xël kompartmënt un ti homeostasis hale. Neekst ti xlisel-petaytungs sorte, is ti rol fon te lipide in te kinesin sorte im protses fon te sekreteere transport en lang tsayt basis frooch woo noch net keantwort kep waar. Hier, mache mer 3D simultaan multifarwiche hooch-resolutsioon real-taim foerxtelunge fer in vivo se pewayse tas ti naychkheete fon te glikosilfosfatidilinositol-immopilierte protukte mit fiil lange keramide lipide xpiichelcher sin kluster un klassifitseert kep in spetsiaaliseerte endoplasme Net transmembrane ausgangs site, was is. Tsum payxpiil, tsayche mer tas ti ketrënk lëngte fon te keramide in te endoplasma retikulum membraan kritixe sin fer tiise sorte selektiwiteet. Unser xtuutium kept ti eyerxte direkte in vivo pewaysunge fer ti protuktsioon fon protukte woo ti protuktsioon fon protukte uf te lipide ketrënke in selektiife eksport sites in te sekretsioons weech xtele.
In te eukariote xëlcher, kewe ti proote woo im endoplasma retikulum (ER) sintetisiert kewe, tan sorteyert wën se transportiert kewe torich te sekretsioons weech fer ti liwre in sayn richtiche xëlwer xtel (1). Neekst ti sorte fon te mantel-petaytung, waar lang tsayt spekuliert kep tas ëtliche lipide aach als selektiife ausxtëlungs phunkte tiine khëne, torich ti kluster fon tëne in spetsiifixe membraan domaine woo spetsiifixe proote (2-5). Awer, es kept noch en manktum fon direkte in vivo pewaysunge fer tiise meechlich lipide-basierte mechanisme pewayse. Um tiise xlisel propleem se lëye, hon mer in te hefe xtuteyert wii ti glykosilfosfatidilinositol (GPI) anker protukte (GPI-APs) tiferensiaal fon te ER eksportiert kewe. GPI-APs sin een ferxiitne lipide-ferpintung fon te xël oopst proote ( 6, 7). GPI-AP is en sekretiirt proot woo an te auswënich xlisel fon te plasma membraan torich te glikolipide teel (GPI anker) aan keprung kept. Tii aksepteere GPI-anker als konserwatiif noo-translatsioons motife in te ER-lumen (8). Noch noo te aanxtrëngung, keet te GPI-AP torich tas Golgi-Aparaat (5, 9) fon te ER pis an ti plasma membraan. Ti presëns fon GPI-anker macht tas ti GPI-AP separat fon te transfusioone fon te transfusioone fon te mënxe (inklusiif anere plasma membraane protukte) iwer te sekretsioons weech transportiert kept (5, 9, 10). In te hefe xëlcher, kewe GPI-APs fon anere sekreteere protukte im endoplasma retikulum ap kexnit, un tan kewe se in unike vesikele ferpakt, woo fon te mantel protukt komplëks II (COPII) um keprung kep sin (6, 7). Ti determinante fon tëm xprooch xraywe protses im ER-Export Protses sin net klaar, awer es kept spekuliert tas tee mechanisme ti lipide ferlange khan, ekstra ti strukturaal remodelung fon te lipide teel fom GPI-Anker (5, 8). In te hefe, fangt ti GPI lipide remodelung aan klaych noo tëm te GPI sich aanxtrëngt, un in fiile fële, macht tas ti seramide sich an te 26-karbon-lang-ketrënk-kexnitne fet asiat (C26:0) ferpint (11, 12). C26 keramide is ti haupst keramide woo pis hayt fon te hefe xëlcher protutseert kept. Es kept in te ER sintetisiert un te meyerxte teel fon tëm kept in te Golgi-Aparaat torich COPII-Vesikele eksportiert (13). Ti ER-Export fon GPI-AP ferlangt spetsiifix ti forterung fon te keramide sintesis (14, 15), un in te richtich tsayt, ti konwersatsioon fon te keramide in inositol fosfaat sintesis (IPC) im Golgi-Aparaat hëngt fon te GPI-Anker Sintesis ap (16). Biofisixe xtuutium mit artifisiaale membraane hon ketsaycht tas ti kanse lange asiyl ketrënke fon te seramide sich fersamle khëne fer orkanisatsioons domain mit unike fisixe propleeme se forme (17, 18). Ti data fier ti hypothees tas C26-seramide un GPI-AP mit C26-seramide sayn fiisixe propleeme penutse fer sich in orkanisatsioons rechioon ore rechioon in te relativ xpasich ER-membraan lipide umfelt ferklayche. Es is hauptseechlich fon khortse un unkefërepte gliserolipide (C16:1 un C18:1) kemacht kep (19, 20). Ti rechioon wërt selektiife foer kexlaa kewe uf spetsiifixe ER ausxtëlungs sites (ERES), woo ti seramiid un ti seramiid-basierte GPI-AP in te selwich dedikeert COPII-vesikel ko-transportiert kewe khëne in te Golgi (5).
In tee xtuutium, hon mer tiise lipide-basierte mechanisme direktsioone keproopt torich ti penutsung fon super-resolutsioon konfokaal real-taim imaterial mikroskopii (SCLIM), woo en xpits puuch mikroskopii teknolokii is woo simultaan fluoresëns markierte proote peopachte khan Ti tray-farwe un tray-dimensioone lipelu in hooch resolutsioon un 3D imaterial (3D) . (21, 22).
Meyer hon ëyerxt SCLIM teknolokii aankewënt fer noch mool se pewayse wii ti normaale GPI-AP mit C26-Krupe fon te transfusioone fon te transfusioone fon te ER in S. cerevisiae aus kexproch kep waar. Um ti ER-klasifikatsioon se kontroliire, hon mer en geneetixe sisteem penutst woo ti naychkheete fon te sintetisierung fon te last woo in te ERES in vivo rin keet, direktsioone visualiseere khan (7, 23). Als last, hon mer C26 keramiid-basiert GPI-AP Gas1 raus kesuucht, woo mit krëns fluoresëns proot (GFP) markiert kep waar un transmembraan sekreteyert proot Mid2, woo mit neekst-infraroote fluoresëns proot (iRFP) markiert kep waar, woo ti tswaay ti plasma membraan tsiye (24–26). In te sec31-1 temperatuur-sensitiif mutatsioon, sin ti tswaay last aus kexproch kep uner en galaktose-influëns promotor un en konstitutiif ERES-marker. In te ekstreem temperatuur (37°C), wayl ti sec31-1 mutatsioon ti funktsioon fon te COPII-Kroos Komponënt Sec31 petreft, fer ti COPII-Krupe un ER-Export inhiweyeere, tuut ti nay sintetisiert last sich in te ER samele (23). Noo tëm se pis an en nikel temperatuur (24°C) kefërept kep sin, hon ti sec31-1 mutante xëlcher sich fon te sekretsioons area erhool, un ti aankesammelt naychkheete fon te sintetixe last hot aankefang fon te ER se eksportiire. CLIM-visuaaliseerung hot ketsaycht tas ti meyerxte fon te naychkheete fon te Gas1-GFP un Mid2-iRFP noch mool in te ER fon te sec31-1 mutante xtele noo inkubatsioon in 37°C un tan sin se in 24°C fer 5 minute fray keprung kep (Figura 1). Wayl Mid2-iRFP uf te kans ER-membraan ferprayt kept, un Gas1-GFP sich konsentreyert un in te diskontinuiteet fon te ER-membraan area fersamle tuut, is sayn ferpraytung kans anerxter (Figura 1, A pis C un Film S1). Tsum payxpiil, wii in te fikuur 1D ketsaycht kept, hot te Gas1-GFP-Kluster khee Mid2-iRFP. Ti resultaate tsayche tas GPI-AP un transmembraan protukte friier in unerxiitliche ER membraan rechioons keteelt kep sin. Ti Gas1-GFP-Kluster is neekst an en spetsiifixe ERES-Krupe woo mit mCherry sayn COPII-Krupe Protukt Sec13 markiert kept (Figura 1, E un F, un Film S1) (23).
sec31-1 xëlcher aus xpreche fon galaktose-influëns sekretsioone, en lang asyl ketrënk (C26) keramiid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, kreen) un te transmembraan protukt Mid2-iRFP (TMP, blau) un tiise Konstruktiif ERES-markierung Sec13-mEScu in magenta70. minute, pis 24°C, un 5 minute xpeeter fon SCLIM ketsaycht kep. (A pis C) tsaycht en representatiif ferpintung ore eensichste 2D pilt fon en plans (A), en 2D proyektsioons pilt fon 10 z-xpiichle (B) ore en 3D xël hemisfëre pilt fon last un ERES marker (C). Skala xteen 1μm (A und B). Ti skala eenheet is 0,551μm (C). Gas1-GFP waar in diskrete ER rechioon ore krupe kefun kep, wën Mid2-iRFP kefun kep waar un is in te kans ER membraan ferprayt kep (C). (D) Te xtraal tsaycht ti relatiif fluoresëns intensiteet fon te Gas1-GFP un Mid2-iRFP in te Gas1-GFP-Krupe in te ways xtraal xtraal (links). AU, eenheid eenheid. (E un F) representiire tas 3D pilt woo ti xprooch un ti ERES marke kombiniirt. Gas1-GFP-krupe sin in te ticht fon te spetsiifixe ERES kefun kep. Ti skala eenheet is 0,551μm. (F) Te ways solide xpits puuch markeert te Gas1-GFP-Kluster woo mit ERES ferpun kept. Ti mitle un rechts paneele tsayche tas ferklaycht ferkreest 3D pilt un en rotatsioons siit fon te auskesuuchte Gas1-GFP-Kluster.
Ti ticht raum relatsioon tswixe te Gas1-GFP-Kluster un en spetsiifixe ERES tsaycht tas Gas1-GFP in selektiife ERES rin keen khan, was anerxter is wii ti selektsioon woo fon Mid2-iRFP penutst kept fer ti ER ferlase. Fer tiise meechlichkheet aan wëne, hon mer ti ERES-Ratio fer ploos een ore tswaay xprooche kwantifitseyert (Figura 2, A pis C). Meyer hon kefun tas ti meyerxte ERES (70%) ploos een sort last hon. Tas uner pilt fon te fikuur 2C tsaycht tswaay tiwersiteet fon ERES mit ploos Gas1-GFP (fikuur 1) ore ploos Mid2-iRFP (fikuur 2). Im keeche teel, unkefeyer 20% fon te ERES hon tswaay last woo sich in te selwich rechioon iwerxpreche. Es is kefun kep tas etliche ERES (10%) tswaay sorte last hon, awer tii sin in klaych unerxiitliche pletse isoliert kep. Tesweche, tsaycht ti statistik analyse tas noo tëm ti ER aus kexproch kept, ti GPI-AP Gas1-GFP un ti transfusioone fon te transfusioone fon te Mid2-iRFP in unerxiitliche ERES keteelt kewe (Fikuur 2D). Ti sorte efisiëns is kans konsistent mit te foerxtelunge fon te biokimixe analyse (6) un ti morfolookix petaytung (7). Meyer khëne aach tas kexicht fon te karanteere layt woo in te ERES rin keen, noo kuke (Figura 2E e Film S2). Ti fikuur 2E tsaycht tas ploos en kleene teel fon te Gas1-GFP (panel 3) ore Mid2-iRFP (panel 4) fon en sayt in te ERES rin keet un in en diskrete area kexlos kept. Panel 5 fon te Fikuur 2E tsaycht tas Gas1-GFP un Mid2-iRFP manich mool in te selwiche ERES kefun kewe, awer tii khome fon unerxiitliche sayte un sin in separate rechioons konsentreyert woo unerxiitliche COPII-vesikele representeere khëne. Meyer hon aach pekhant kemach tas ti peopachtung fon te separatsioon un klassifikatsioon fon C26-keramide-basierte GPI-AP Gas1 als selektiife ERES spetsiifix is, wayl en anere transfusioone sekretsioons last, te GFP-markiert plasma membraan protukt Axl2 (27 ), tsaycht en ëkstra ferhale wii Mid2-iRFP. (Pilter S1 un Film S3). Ti nay sintetisiert Axl2-GFP is torich ti ER-membraan ferprayt kep wii Mid2-iRFP (Fikuur S1, A un B), un is mit Mid2-iRFP in te meyerxte ERES ko-lokaliseyert kep (Fikuur S1, B pis D). Paneele 1 un 2 fon te Fikuur 1. S1C tsaycht tswaay tiwersiteet fon ERES woo tswaay transmembraan last sich iwer xtele. In tëne kefale, tuun ti tswaay xprooche in te ERES rin keen (Figura S1E, Panel 3 e Film S3).
Ti sec31-1 xëlcher woo ti galaktose indutsierte sekwënse aus xpreche, Gas1-GFP (GPI-AP, kreen) un Mid2-iRFP (TMP, blau) un konstitutiif ERES markeere Sec13-mCherry (ERES, magenta) waare uf 37 Noch noo inkubatsioon fer °C pis 30 °C ti sekreteere mowimënt. blok, un pilt mit SCLIM noo 20 minute. (A pis C) Representatiiwe 2D proyektsioons pilter (A; xtraal xtraal, 1μm) ore 3D xtraal hemisfëre pilter (B un C; xtraal eenheet, 0,456μm) fon te last un 10 z-sektsioone woo fon ERES markiert kep sin. Tas unerxiitliche panel in (B) un te panel in (C) tsayche ferprayt pilter fer ploos ti ërnt fon te ERES (magenta) [Gas1-GFP (grau) un Mid2-iRFP (licht blau)] tsayche. (C) Oone pfeil: ERES pringt ploos een xtuk last (1 pis 4). Grau pfeil: ERES enthält separate last (5). Wit solide pfeil: ERES mit ko-lokaliseerte last. Uner: Ti auskesuuchte eensiche ERES hon ploos Gas1-GFP (1) orer Mid2-iRFP (2). Skala xteen, 100 nm. (D) Kwantifikatsioon fon te fotomikrofone woo in (C) pexrip sin. Te tswixe prosent fon te ERES woo ploos een last (Gas1-GFP ore Mid2-iRFP) enthalet, ti last woo separat kept un ti last woo sich iwerlaypt. In tray unaafhängiche xprooche, n=432 in 54 xprooche. Feeler xteen = SD. Zwee-schwanz unpaart t test. *** P = 0,0002 tas. (E) 3D pilt fon auskesuuchte ERES fon karanteere last markiert mit (C). Gas1-GFP (kroos) (3) ore Mid2-iRFP (blau) (4) khomt fon en sayt in te ERES (magenta) un is in en kleene plats in te ERES kexnit kep. Manich mool, tuun ti tswaay sorte last in te selwich ERES (5) rin keen fon te selwich sayt un sin in en isoliert plats in te ERES kexlos kep. Skala xteen, 100 nm.
Als neekst, hon mer en hypothees keproopt tas ti lang asyl ketrënk seramit (C26) woo in te ER-membraan presënt kept, ti spetsiifixe krupe un sorte fon Gas1 in selektiife ERES treet. Tsum ën, hon mer en motiweyert hefe xtam GhLag1 penutst, woo ti tswaay endokriine seramide sintesis Lag1 un Lac1 ersat hot mit GhLag1 (te Lag1 homolook fon te kotona), was en hefe xtam mit en xël membraan Ceramide xtam khorter wii wilt tiire pringt (Figura 3A) (2). Ti analyse fon te mass spektrometrii (MS) hot ketsaycht tas in wilt tiire, 95% fom kanse seramiid is kans lang (C26) ketrënk seramiit, wën in GhLag1, 85% fon te seramiit is kans lang (C18 un C16). ), ploos 2% fon te keramide sin kans lang (C26) ketrënk keramide. Opwool C18 un C16 keramide ti haupste keramide sin woo in te GhLag1 membraan pis hayt kefun kep sin, hot ti MS analyse aach pekhant kemach tas te GPI-Anker fon Gas1-GFP woo in te GhLag1-Stam aus kexproch kept, C26 keramide enthalet, was ferklaychbar is mit wilt tiire lipide. Ti kwaliteet is ti selwich (Figura 3A) (26). Tesweche, petayt tas tas te keramide remodelungs enzym Cwh43 hooch selektiif is fer C26 keramide, wii in te fikuur 26 ketsaycht kept, tas tee ti GPI-Anker fon en kleene numer fon C26 keramide in te GhLag1-Stam influëntsiert. S2 (29). Trotzdem, ti xël membraan fon GhLag1 hot im xlisel ploos C18-C16-seramiid, wën Gas1-GFP noch C26-seramiid hot. Tiise fakt macht tas tiise xtam en ideaal instrumënt is fer ti propleeme fon te asyl ketrënk lëngte fon te membraan keramide in te ER spetsiifix se lëye. Ti hypothetixe rol fon te xprooch un ti sorte. Tan, hon mer ëyerxt ti kapasiteet fon C26 Gas1-GFP fer sich in krupe in GhLag1 aansamle mit en temperatuur-sensitiif mutatsioon fon sec31-1 torich konvensioneel fluoresëns mikroskopii xtuteyert, woo ploos ti lang (C18-C16) ketrënk in te ER membraan Ceramide eksistiirt (Figura 3). Meyer hon ketsaycht tas in sek31-1, te meyerxte teel fon te Gas1-GFP in krupe konsentreyert kep waar, wën Gas1-GFP in sek31-1 GhLag1 mit lange (C18-C16) lang keramide ER membraan hauptseechlich net kexlos kep waar un ferprayt kep waar in In te kans ER membraan. Fer preserweere, wayl ti C26-seramide-basierte kluster ticht an spetsiifixe ERES sin (Figura 1), hon mer neekst unersuucht ep tee protses aach ti funktsioon fon te ER-Export Protukt Mekanismus influëntsiere khan. GPI-AP penutst en spetsiaal COPII-System fer ER-Export, woo aktiif rekularisiert kept torich Ted1′s strukturaal remodelung fon te glikan teel fon te GPI-Anker (30, 31). Ti rekombinant GPI-glikan is tan erkhënt kep fon te transmembraan last reseptor p24 komplëks, woo in te richtung fon te Lst1 selektiif rekruteyert, woo en spetsiifixe isoform fon te kroose COPII last ferpintungs unerxtitsung Sec24 is, woo en GPI-AP-richtich COPII Vesikele sin neetich (33). Tesweche, hon mer en tswaayxproochik mutatsioon konstruiert woo ti xlisel fon tëne eensiche protukte (te p24 komplëks komponënt Emp24, te GPI-glikan remodelungs enzym Ted1 un te spetsiifixe COPII-unerxiit Lst1) mit te sec31-1 mutante xtam kombineert hot, un hon se xtuteyert Is es meechlich GFP1-cluster se forme (Fikuur Gas1-c3). Meyer hon ketsaycht tas in sek31-1emp24Δ un sek31-1ted1Δ, te Gas1-GFP hauptseechlich unkexnit kept un ferprayt sich in te kans ER-membraan, wii es foer heyer kesiin kep waar in sek31-1 GhLag1, wën in sek31-1lst1Δ, Gas1-GFP Soo wii sek3. Ti resultaate tsayche tas neekst ti kans presëns fon C26-seramide in te ER-membraan, ti xliisung fon te Gas1-GFP aach in te p24-komplëks ferpint, un praucht net spetsiifixe Lst1-rekrutatsioon. Tan, hon mer ti meechlichkheet unersuucht tas ti ketrënk lëngte fon te seramide in te ER-membraan ti ferpintung fon Gas1-GFP mit p24 rekulaariseere khan. Awer, hon mer kefun tas ti presëns fon C18-C16 keramide in te membraan net ti GPI-glikans rekonstruiert kept fon te p24 komplëks (Figuras S3 e S4, A e B) ore ti ferpintung mit GPI-AP un eksportiirunge fon GPI-AP. apiliteet. Rekruteere COPII-untertipe Lst1 (Figura S4C). Tesweche, praucht C26-seramide-afhanklich kluster net protuktsioons interaktsioone mit unerxiitliche ER-eksport protuktsioons mechanisme, awer unerxtits en alternatiife sorte mechanisme woo fon te lipide lëngte ketreest kept. Tan, hon mer analysiert op ti seramiid asil ketrënk lëngte in te ER membraan important is fer ti effektiif xpiichlung fon Gas1-GFP als selektiife ERES. Wayl Gas1 in te GhLag1 xtam mit kurts ketrënk keramide ti ER ferlaat un in ti plasma membraan rin keet (Figura S5), klaawe mer tas wën ti sorte fon te xtam fon te seramide acyl ketrënk ketreest kept, khan te Gas1 in te GhLag1 xtam noo keen un kexnit kewe. ERES-waar mit te selwiche membraan.
(A) Ti xël membraan fon GhLag1 hot hauptseechlich khortse C18-C16-seramide, wën te GPI-anker fon Gas1-GFP noch ti selwich C26 IPC hot wii ti wilt tiire xël. Uf tëm pilt: asyl ketrënk lëngte analyse fon te keramide in te xël membraan fon wilt tiire (Wt) un GhLag1p xtame torich mass spektrometrii (MS). Ti data representiire te perseenlich prosent fon te kanse keramide. Te tswixich tsayt fon tray unaafhängiche eksperimente. Feeler xteen = SD. Zwee-schwanz unpaart t test. **** P <0,0001 tas. Unerxiitliche paneele: MS-analyse fon te asyl ketrënk lëngte fon te IPC woo in te Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-Anker aus kexproch kept in te wilt-tiire un GhLag1p-xtam. Ti data representiire te prosentxaft fon te kans IPC-Signaal. Durchschnittliche fon 5 unaafhängiche eksperimente. Feeler xteen = SD. Zwee-schwanz unpaart t test. ns, nët wichtich. P = 0,9134 tas. (B) Fluoresëns mikrokrafe fon sek31-1, sek31-1 GhLag1, sek31-1emp24Δ, sek31-1ted1Δ un sek31-1lst1Δ xëlcher woo ti galaktose-influëns fon te Gas1-GFP aus xpreche, waare inkexpërt kep uf 37°C runer kexnit kep fer Perscopyforme un Perscopy3. noo 24°C. Wit pfeil: ER Gas1-GFP-Kluster. Oone pfeil: Unkliklich Gas1-GFP is uf te kans ER membraan ferprayt, was ti ER karakteristixe nuklear ring farwe tsaycht. Skala xteen, 5μm. (C) Kwantifikatsioon fon te fotomikrofone woo in (B) pexrip sin. Te tswixe prosent fon te xëlcher mit punkte Gas1-GFP struktur. In tray unaafhängiche eksperimente, n≥300 xëlcher. Feeler xteen = SD. Zwee-schwanz unpaart t test. **** P <0,0001 tas.
Fer tas propleem direktsioone se lënke, hon mer SCLIM-Visuaaliseerung fon Gas1-GFP un Mid2-iRFP in GhLag1 mit te sec31-1 temperatuur-sensitiif mutante alel kemacht (Fikuur 4 un Film S4). Noo tëm ti ER uf 37°C kehal kep waar un noo heyer uf 24°C aus keprung kep waar, is te meyerxte teel fon te naychkheete fon te Gas1-GFP net mee kexnit kep un is in te kans ER membraan ferprayt kep, wii es fon konwentsionaale mikroskope kesiin kep waar (Figura 4, A e B ). Tsum payxpiil, en kroose prosentxaft fon te ERES (67%) hot tswaay sorte last woo too tepay sin (Figura 4D). Ti paneele 1 un 2 fon te fikuur 4C tsayche tswaay tiwersiteet fon ERES mit iwerxprechung fon Gas1-GFP un Mid2-GFP. Tsum payxpiil, ti tswaay xprooche sin in te selwich ERES rekruteyert kep (Figura 4E, panel 3 e film S4). Tesweche, tsayche unser resultaate tas ti lëngte fon te seramide asyle ketrënke in te ER-membraan en important petaytung fon te ER-protukt agretsioon un klassifikatsioon is.
Sec31-1 GhLag1-xëlcher woo ti sekwëns fon te galactose-influëns aus xpreche, Gas1-GFP (GPI-AP, kreen) un Mid2-iRFP (TMP, blau) un konstitutiif ERES-markierte Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkuweere in 37°C. minute wayter, lose mer pis 24°C fer ti sekwëns fon te sekwënse aus lëye, un noo 20 minute mit SCLIM imaterial mache. (A pis C) Representatiiwe 2D proyektsioons pilter (A; xpiichel xpiichel, 1μm) ore 3D xpiichel hemisfëre (B un C; xpiichel eenheet, 0,45μm) fon te 10 z-sektsioone woo fon te last un ERES markiert kep sin. Tas unerxiitliche panel in (B) un te panel in (C) tsayche ferprayt pilter fer ploos ti ërnt fon te ERES (magenta) [Gas1-GFP (grau) un Mid2-iRFP (licht blau)] tsayche. (C) Wit gefëlt pfeil: ERES, waren overlap. Open pfeil: ERES enthält ploos een itee. Uner panel: Te auskesuuchte ERES hot iwerxprechungs krupe (1 un 2) in (C) markiert. Skala xteen, 100 nm. (D) Kwantifikatsioon fon te fotomikrofone woo in (C) pexrip sin. In te sec31-1 un sec31-1 GhLag1 eenheete, kept ploos een last (Gas1-GFP ore Mid2-iRFP) inkexlos, un te tswixe prosent fon te ERES fer isolierte last un iwerxprechungs last. In tray unaafhängiche xprooche, n = 432 in 54 xprooche (sec31-1) un n = 430 in 47 xprooche (sec31-1 GhLag1). Feeler xteen = SD. Zwee-schwanz unpaart t test. *** P = 0,0002 (sek31-1) un ** P = 0,0031 (sek31-1). (E) 3D pilt fon auskesuuchte ERES mit iwerxprechungs last (3) markiert in (C). Gas1-GFP (kroos) un Mid2-iRFP (blau) khome an te ERES (magenta) fon te selwich sayt un playwe in te selwich ERES-rechioon. Skala xteen, 100 nm.
Ti xtuutium kept direkte in vivo pewaysunge tas ti lipide-basierte protuktsioons mitel in selektiife eksport sites in te sekretsioons weech xtele, un tsaycht ti importans fon te asyl ketrënk lëngte fer ti selektsioons selektiwiteet. Mit en kraftiche un xpits puuch mikroskopii tekniik woo SCLIM heest, hon mer ti nay sintetisiert Gas1-GFP (en kroos plasma membraan GPI-AP mit en kans lang asyl ketrënk (C26) keramide lipide portsioon) in hefe ketsaycht ) Ti rechioons woo in diskrete sekreteere protuktsioons spetsiifixe ERs ferprayt sin, sin ferpint kep . ti ER-membraan (Figura 1). Tsum payxpiil, ti tswaay sorte fon ërepxafte khome selektiif in unerxiitliche ERES (Figura 2). Ti asyl ketrënk lëngte fon te xëlwer seramiid in te membraan is fon C26 pis C18-C16 kexnit kep, te Gas1-GFP-krupe is in te diskrete ER-rechioon ferxwun, un te Gas1-GFP is noo kekukt kep fer ti ER mit te transmembraan protuktsioon torich ti selwich ERES se lose (Figura 3 un Fikuur 3). 4).
Opwool GPI-AP en spetsiaal protuktsioons mechanisme penutst fer ER aus se hale, hon mer kefun tas ti C26-seramide-afhanklich separatsioon net uf tiferensiaale protuktsioons interaktsioone xteet woo ti ERES spetsiaaliseerung pringe khan (Figuras S4 e S5). Statt tas, unser entwiklung unerxtits en alternatiife xpiirungs mechanisme woo fon te lipide-basierte protuktsioons krupe un ti nookhomer ausxlus fon anere last ketreest kept. Unser opserwayrunge tsayche tas ti Gas1-GFP rechioon ore kluster woo mit en spetsiifixe ERES ferpun kept, te transmembraan sekretsioons protukt Mid2-iRFP ferliert, was petayt tas te C26-seramide-afhanklich GPI-AP kluster sayn influëns in te relewante ERES erlaychtert, un in te selwich tsayt, tiise spetsiifixe transmembraan un ti ESERu ausxlus mache (Fig. 2). Im keeche teel, ti presëns fon C18-C16-keramide in te ER-membraan macht net tas ti GPI-AP ti rechioon ore ti xtet uf paue tuut, soo tas se net ti transmembraan sekreteere protukte in te selwiche ERES aus xlus mache ore ersetse (Figuras 3 e 4). . Tesweche, xtele mer foer tas C26-seramide ti separatsioon un klassifikatsioon aan piit, torich ti erlaupnis fon te xpiichlung fon protukte woo mit spetsiifixe ERES ferpun sin.
Wii khan mer tiise C26-seramide-afhanklich kluster in en spetsiifixe ER-area erkhëne? Ti tentëns fon te membraan keramide fer sich lateraal se xpaare khan mache tas ti GPI-AP un C26 keramide kleene un instantanees orkaniseyerte lipide in te mee unreel lipide umfelt fon te ER membraan woo khortse un unkefërepte glicerolipide enthaale. Kwaliteet krupe (17, 18). Tiise kleene tsaytliche krupe khëne noch mool in kreesere, staapel krupe ferpint kewe noo tëm se an te p24 komplëks kexnit kep sin (34). Konsistent mit tëm, hon mer ketsaycht tas C26 Gas1-GFP mit em p24 komplëks interakteere mus fer kreesere sicherheets krupe se forme (Figura 3). Te p24 komplëks is en heterozygote oligomeer woo fon fier unerxiitliche p24 transmembraane protukte in te hefe komponiert kept (35), woo multi-walente ferpintunge pringt, was ti ferpintung fon kleene GPI-AP-Kluster pis an ti ferpintung fon kleene GPI-AP-Kluster pringt, un soo, en kreesere Stabil-Kluster genereere (34). Ti interaktsioon tswixe te protuktsioons ektodome fon te GPI-APs khan aach en tayl fon tëne sayn agretsioon pringe, wii es ketsaycht kept iwer tëne sayn Golgi-Transport in mamalia polariseyerte epitel seele (36). Awer, wën C18-C16-seramiid in te ER-membraan presënt is, wën te p24-komplëks sich an Gas1-GFP ferpint, wëre kroose separate krupe net keformt. Te unerxtitsungs mechanisme khan fon te spetsiifixe fiisixe un kemixe propleeme fon te lange asyl ketrënke keramide ap hënge. Biofisixe xtuutium fon artifisiaale membraane tsayche tas, opwool tswaay lange (C24) un khortse (C18-C16) asyle ketrënke ti phase separatsioon pringe, ploos ti lange asyle ketrënke (C24) khëne ti hooch Kurwe un film xpiirung promoweere fer te film noch mool se forme. Torich ti tswaay sayte (17, 37, 38). Es is ketsaycht kep tas ti transmembraan helix fon TMED2, te mënxliche homolook fon Emp24, selektiife interaktsioone mit C18-keramide-basierte sfingomiilin in te citoplasma lose (39). Mit te penutsung fon te simulatsioone fon te molekulaare dynamik (MD), hon mer kefun tas ti tswaay C18 un C26 seramide sich um ti sitoplasma lose fon te Emp24 transmembraan helix rom samele, un tii hon ti selwiche preferënse (Figura S6). Es is important se wise tas tas tsaycht tas ti transfusioone fon te Emp24 pis an ti asimetrix ferpraytung fon te lipide in te membraan nëme khan. Tas is een rexënt resultaat woo fon te mama xëlcher kemacht kep is. Similiare MD simulatsioone tsayche aach ti presëns fon eter lipide (40) . Tesweche, spekuleere mer tas C26-seramide in te tswaay lobule fon ER26 lokal fertiint. Wën te GPI-AP in te luminal lobule sich direktsioone fer multi-walent p24 un ti akkumulatsioon fon C26-seramide um p24 rom in te citoplasma lose, khan es ti pekhante Protein agretsioon un ti membraan krupe fon te lose sin torich ti fingere kexproch kep (41), was fer ti GPI-AP sich aach in ti diskrete rechioon xtele tuut, woo ti diskreja rechioon fon te ER-membraan (42). Ti foerxritne pekhantmachunge hon te propoos mechanisme unerxtitst (43, 44). Ti multi-walente ferpintung fon oligolektiine, patoogene ore antikörpere fer ti seramide-basierte glykosfingolipiide (GSL) uf te plasma membraan, pringt kroose GSL-agretsioon aus, ferkreest ti phase separatsioon un macht ti membraan ferformung un internatsionaaliseerung (44). Iwabuchi usw. (43) Es is kefun kep tas in te prezëns fon lange (C24) awer net khortse (C16) asyl kexënke, te multi-walent ligant woo an GSL laktosilseramiid kexnit kept, ti forterung fon kroose xpiichelcher un membraan influëns influëntsiert, un ti citoplasma Lyn-petaytungs siinaal transtuktsioon torich chagitropleet is interaktiif.
In ti polariseerte epitel xël fon te mama, ti konsentraatsioon fon te antike xpiichle (TGN) uf em niwel fon te apikaal plasma membraan kontroliert ti separatsioon un sorteere fon GPI-AP (10, 45). Ti agretsioon is fon te GPI-AP oligomerisatsioon ketreest kep (36), awer khan aach fon te keramide ketrënk lëngte woo mer in te hefe fine, ap hënge. Opwool ti mama GPI-AP en eter lipide-basiert anker hot, un sayn kemixe struktur is kans anerxter wii ti kans lang asyl ketrënk keramide, hot en rexënt xtuutium ketsaycht tas ti tswaay lipide ewolutsioons ërepxafte un kemixe propleeme hon Un funktsioon (40). Tesweche, khan te eter lipide teel in te mama seele ëkstra ëkstra fer ti C26-seramide in te hefe sin, un sayn rol is ti ferpintung mit te lang-kheer-seramide in te membraan fer ti GPI-AP-agretsioon un sorteere se promoweere. Opwool ti meechlichkheet noch direktsioone keproopt kewe mus, tuun ti foerxritne entwiklunge unerxtitse tas te transport fon te lange asiyl ketrënke in te Golgi-Kërper net torich ti citoplasma transfusioon protukte aus kefiert kept, awer hëngt an te sintesis fon GPI-ankere wii ti hefe. Tesweche, khomt te ewolutsioons konserwatiif mechanisme foer, woo ti selwiche transport vesikel selektiif ko-transporteere khan, woo ti kans lang tsayt fon te asiil ketrënke un ti GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in te selwich transport vesikel ko-transporteere khan.
In hefe un mamalixe polariseyerte epitel xël sisteeme, GPI-AP-Agretsioon un Separatsioon fon anere plasma membraan protukte paseere ales eep se ti xël oopst peem erkhëne. Paladino un ti anere. (48) hon kefun tas uf te TGN fon te mamalia polariseyert epitel seele, GPI-AP-Krupe net ploos neetich is fer ti selektsioon fon te GPI-APs fer ti apikaal plasma membraan, awer aach ti kluster orkanisatsioon fon GPI-APs un Sayn biolookix aktiwiteet rekularisiert. Cellul oopst peem. In te hefe, hot tiise xtuutium ketsaycht tas te C26-seramide-afhanklich GPI-AP-Kluster uf te ER ti kluster orkanisatsioon un funktsioons aktiwiteet fon GPI-AP uf te plasma membraan rekulaariseere khan (24, 49). Konsistent mit tëm model, sin ti GhLag1-xëlcher alerjix fer GPI-inhikericher ore mërkmale woo ti intekriteet fon te xëlcher petrefe (28), un ti neetichkheet fer funktsioons Gas1-GFP-krupe (49) fon te xpits puuwe proyekteyert in te ferpintung fon hefe xëlcher tsaycht G Mëchliche fisiolookixe konsekwënse fon hLag1. GPI-AP-fehler. Awer, wayter testiire op ti funktsioons orkanisatsioon fon te xëlwer oopst peem fon te ER torich en sorte methook woo uf te lipide lëngte basiert, wërt tas theema fon unser tsukhunft forxung sin.
Ti sorte fon Saccharomyces cerevisiae woo in tiise aarwat penutst kep sin, sin in te Tawel S1 ketsaycht kep. Ti MMY1583 un MMY1635 xtame fon SCLIM fer leewent xëlwer imaterial sin im hinergrund fon W303 konstruiert kep. Ti xtame woo Sec13-mCherry mit en fluoresënt protuktsioons xtek aus xpreche, sin mit en polimeraas ketrënk reaktsioon (PCR)-basiert methook mit pFA6a plasmid als xtel kexrip kep (23). Ti xtam woo Mid2-iRFP aus xprecht, mit fluoresëns protukt uner te kontrol fom GAL1-promotor, waar soo konstruiert kep. PCR-amplifikatsioon fon iRFP-KanMx-sekwëns fon pKTiRFP-KAN-vektor (kexënk fon E. O’Shea, Addgene plasmid numer 64687; Noo tëm ti Mid2-iRFP-Xenom Sekwëns ferkreest kep waar un in te GAL1-Promotor klooniert kep waar, is se in te Not I-Sac I-Site fon te Intekratsioons Plasmid pRS306 intekriert kep. Tas resultaat fon te plasmid pRGS7 is mit Pst I linearisiert kep fer in te URA3-lokus intekriere.
Tas Gas1-GFP-Fusioons-Gen is aus kexproch kep uner te kontrol fom GAL1-Promotor in te sentrum (CEN) plasmid, woo soo konstruiert kept. Ti Gas1-GFP-Sekwëns is torich PCR ferkreest kep fon te pRS416-GFP-Plasmit (24) (kexënk fon L. Popolo) un is in te Xma I–Xho I-Site fon te CEN-Plasmit pBEVY-GL LEU2 (kexënk fon C) klooniert kep . Miler tas; Plasmid numer 51225; 51225; RRID: Aanfang_51225). Tas resultaat fon tëm plasmid waar pRGS6 kenënt. Tas Axl2-GFP-Fusioons-Gen is aach aus kexproch kep uner te kontrol fom GAL1-Promotor fom pBEVY-GL LEU2-Vektor, un sayn konstruktsioon is soo. Ti Axl2-Sekwëns is fon te pRS304-p2HSE-Axl2-Plasmit (23) torich PCR ferkreest kep, un is in te Bam HI-Pst I-Site fon pBEVY-GL LEU2-Vektor klooniert kep. Tas resultaat fon tëm plasmid waar pRGS12 kenënt. Ti sekwëns fon te oligonukleotiide woo in tiise xtuutium penutst kep sin, is in te Tawel S2 ketsaycht kep.
Ti xtam waar mit 0,2% adenin un 2% glukoos [YP-dextroos (YPD)], 2% rafinoos [YP-rafinoos] raychlich hefe ekstrakt proot p (YP) mittel (1 % hefe ekstrakt un 2% proot ept) erfiilt kep. (YPR)] ore 2% galaktose [YP-galaktose (YPG)] als kolt xprits, ore in en sintetixe minimal mittel (0,15% hefe xtik fii un 0,5% amoniak sulfat) fer ti erkhënung fon te richtiche amino asiate un base woo fer ti erneerung neetich sin , Un mit 2% sintetixe glukose2) (sintetixe galaktose minimal mittel) als karbonquelle.
Fer ti real-taim imaterial, waare ti temperatuur-sensitiwiteet fon te sec31-1 mutante xëlcher woo te konstrukt uner te GAL1-promotor aus xpreche, in YPR-Medium in 24°C iwer nacht pis mit-log phase kewakst. Noch noo induktsioon in YPG in 24°C fer 1 xtun, sin ti xliselcher in SG in 37°C fer 30 minute inkexpërt kep, un tan sin se in 24°C iwer ketuun kep fer fon te sekretsioons xtok raus keen. Concanavalin A waar penutst kep fer ti xlisel uf en xlisel se fixe un is fon SCLIM kexpiilt kep. SCLIM is een kombinatsioon fon Olympus IX-71 inwerte fluoresëns mikroskoop un UPlanSApo 100×1,4 numerixe apertuur ële lins (Olympus), hooch-xnëlheet un hooch-siinaal-to-ruum fertiint rotiirente xpiichle konfokaal xpiichler (Yokogawa Elektrik un personalisiert imaaj (Fotonika Hamamatsu) khan een ferkreesungs lins sisteem mit en ën ferkreesung fon ×266,7 un en laytungs-koppelt apteelungs kamera woo ti eletroone multiplitseyert (Fotonika Hamamatsu) (21). Ti pilter se kriin sin torich een personalisiirt softwaer (Yokogawa Elektrix) kemacht kep. Fer 3D pilter, hon mer en xpits puuch penutst fer ti opjektiif lins vertikal se xpiire, un hon ti optixe teele 100 nm fon te anere in en xtek samer ketuun. Tas Z-Stack pilt kept in 3D-Voxel-Data konwerteyert, un ti theoreetixe phunkt ferpraytungs funktsioon woo fer ti rotatsioons xpiichel konfokaal mikroskoop penutst kept, kept fer ti dekonwolutsioons ferarwaytung fon te Volocity Software (PerkinElmer) penutst. In te penutsung fon te Volocity Software fer automatix xtroof fer ti ko-lokatsioons analyse, is ERES inklusive last kemeesert kep. Ti analyse fon te xprooch is kemacht kep mit te hilef fon te Software MetaMorph (Molekulaare Apparate).
Tuu ti softwaer GraphPad Prism penutse fer ti statistixe petaytung se pewayse. Fer te tswaay-xtrit Student’s t-test un te keweenliche eensichste analyse fon te warianse (ANOVA) test, kewe ti unerxiite tswixe te krupe als en sicher impak uf P <0,05 (*) aan kesiin.
Fer ti fluoresëns mikroskopii fon Gas1-GFP, waare ti loch phase xtele iwer ti nacht in YPD kewakst un torich sentrifugatsioon kesammelt kep, tswaay mool mit fosfaat pufërt salsich waser kewaxt kep, un uf em eyerxt 15 minute inkexpërt kep, un tan sin se uner te mikroskoop foran kefaar kep wii foer heyer pexrip kep waar (Check24). Ti mikroskoop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 ële PH3 CS) woo mit en opjektiif lins, L5 (GFP) filter, Hamamatsu Kamera un Applikatsioons Suite X (LAS X) Software aus kestaalt kep waar, is fer ti aktsioon penutst kep. .
Ti protukte sin mit SDS protukt puffer in 65°C fer 10 minute kexnit kep, un tan sin se mit SDS-poliakrilamid-gel elektroforesis (PAGE) kexnit kep. Fer ti imunofluëns analyse, waare 10 μl protukt pro lane kexmis kep. Priimer antikörper: ti kans poliklonaal anti-Gas1 in en fertiinung fon 1:3000, ti kans poliklonaal anti-Emp24 in en fertiinung fon 1:500, un ti poliklonaal anti-GFP (en kexënk fon H. Riezman) in en fertiinung fon 1:300. Ti muus monoklonaal anti-Pgk1-antikörper is in en fertiinung fon 1:5000 penutst kep (en kexënk fon J. de la Cruz). Sekuntaar antikörper: 1:3000 fertiinung fon 1:3000 (Pierce). HRP-konjukeert kexwister anti-muus IgG waar in en fertiinung fon 1:3000 penutst kep (Pierce). Ti imuniteet fon te mënxe is torich ti kemiitlich methook fon te Super-Signaal West Pico Reaktsioon (Thermo Fisher Scientific) ketsaycht kep.
Soo wii in (31) pexrip kept, is en natierlich imunopresipitatsioons eksperimënt uf te fertiint ER fraktsioon kemacht kep. In khorts tsayt, waser ti hefe xëlcher mit TNE-puffer [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorit un protease inhikeriche mixung) in 600 nm ( OD600) uf 100 optik. Es waar mit xlisel kexnit kep, un tan, waare ti xëlcher un ti xlisel perle torich sentrifugatsioon raus kehool kep. Tas super-natant is tan 17.000 g fer 15 minute in 4°C kexpritst kep. Ti peloonung is in TNE resuspensiert kep un ti digitalis saponin is in en ën konsentraatsioon fon 1% kexmis kep. Ti suspensioon is 1 xtun mit rotatsioon in 4°C inkexpërt kep, un tan sin ti unkeweenliche komplëxe 13.000 g in 4°C fer 60 minute raus kehool kep. Fer ti imunopresipitatsioon fon Gas1-GFP, kewe ti protuktsioons mitel foer kexlaa mit leere agarose perle (ChromoTek) in 4°C fer 1 xtun, un tan mit GFP-Trap_A (ChromoTek) in 4°C fer 3 xtune. Ti imunopresipitatsioons perle sin 5 mool mit TNE kewaxt kep, woo 0,2% tigoxigenin enthalung hat, mit SDS protukt puffer eluiert kep, uf SDS-PAGE separat kemacht kep, un torich imunoblotting analysiert kep.
Soo wii in (31) pexrip kept, is ti xprooch petaytung fon te fertiint ER fraktsioon kemacht kep. Kurt tsayt tëm noo, is ti fertiint ER fraktsioon mit 0,5 mM titiopis (suksinimidiil protuktsioon) inkexpërt kep (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ti xlisel reaktsioon is aus kexproch kep torich ti xlisel fon te xlisel (50 mM ën konsentratsioon, 5 minute, 20°C).
Soo wii foer heyer pexrip kep waar (50), is ti MS analyse fon te keramide in wilt tiire un GhLag1 xtame kemacht kep. Kurt, ti xëlcher sin in te eksponential phase kewakst (3 pis 4 OD600 eenheete/ml) in YPD in 30°C, un 25×107 xëlcher sin keërnt kep. Iire metabolismus is mit trikloraat aus kexproch kep. Ti ekstraktsioons soltaat [etanol, waser, eter, piriin un 4,2 N amonium hydroksiit (15:15:5:1:0,018 v/v)] un 1,2 nmol fon interne standart C17-keramiid (860517, Avanti polaar lipid) kwaliteet penutse. Monometilamin reaktsioon [metanol, waser, n-butanol un metilamin lose (4:3:1:5 v/v)] penutse fer ti xlimste alkalixe hydrolyse fom ekstrakt aus fiire, un tan penutse waser-kextërekt n-butanol fer ti entsaltung. Tsum xlus, is te ekstrakt in en positiif motiif soltaat [kloroform/metanol/waser (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] resuspensiert kep un in te mass spektrometer inkexpritst kep. Multi-reaktsioons monitooring (MRM) is kemacht kep fer ti identifikatsioon un kwantifikatsioon fon te sfingolipide moleküle. Ti TSQ Vantage tertiaryx kwadrupool mass spektrometer (Thermo Fisher Scientific) is aus kestaalt kep mit en robotik nano-fluus ioon-krupe Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) fer ti lipide analyse. Ti kolëktsioon enerxii is fer yeete keramide katee optimiseyert. MS data waar in positief modus kriit. Fer yeete biolookix replikatsioon, is tas lipide simpool te mittel fon tray unaafhängiche meechlichkheete.
Soo wii in (31) pexrip kept, ti xlisel (800×107) woo Gas1-GFP aus xpreche, waare natierlich imunopresipitatsioon uner kexproch kep. Ti purifitsierte Gas1-GFP sin torich SDS-PAGE kexnit kep un sin in en polivinilfluorit (PVDF) membraan iwertraut kep. Tas proot waar visualisiert torich PVDF mit amide xwarts ferfluuchung. Ti Gas1-GFP-Band is fon te PVDF kexnit kep un 5 mool mit metaan kewaxt kep un een mool mit fliisich chromatokrafii-MS (LC-MS) xtraal waser. In te inkubatsioon fon te membraan xtraus mit 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), puf un 500 μl frix kexnitne 1 M natrium nitrite mixung in 37°C fer 3 xtune, kept ti lipide fraktsioon fon Gas1-GFP un lyse fon inofamiin fray kemacht (51). Noch tëm, is ti membraan xtraus fier mool mit LC-MS-Klasse waser kewaxt kep, in kamare temperatuur ketrokt kep, un in en stik atmosfëre uf -80°C kexpaart kep pis ti analyse. Als kontrol, waar en leewens mitel protukt fon PVDF-membraan fer yeete xprooch penutst kep. Ti lipide woo fon Gas1-GFP raus kehool kep sin, sin tan fon MS analysiert kep wii se pexrip kep sin (50). In khorts tsayt, sin PVDF xtreeme woo GPI-lipide enthaale, in 75μl neekst xmier xmier [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] resuspensiert kep un hon ti elektroxprits ionisatsioon (ESI)-MRM/MS Analyse fon sfingolipide sorte (TSQ Vantage) kemacht. In tëm kast, waare MS data in neekst ioon modus kriit.
Soo wii xon foer heyer kesaat kep waar, waar te lipide teel fon te GPI-Anker fon te [3H]-inositol-markierte GPI-AP (16) ap kexnit kep. Ti lipide sin torich ti xlisel fon te xprooch fon te mënxe kexnit kep, mit en soltaat systeem (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) un mit te hilef fon FLA-7000 (Fujifilm) visualiseyert kep.
Ti xëlcher woo Gas1-GFP aus xpreche (600×107) sin tswaay mool mit TNE-puffer mit TNE-puffer kewaxt kep, un mit xlisel perle kexnit kep, un tan sin se sentrifukiert kep fer ti xëlcher xlisel un xlisel perle wëch xafe. Tas super-natant is tan 17.000 g fer 1 xtun in 4°C sentrifukiert kep. Ti peloonung is in TNE kewaxt kep un mit 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE mit 0,2% digitalis saponin fer 1 xtun in 37°C inkexpërt kep. Noo te enzym tratamënt, is ti membraan torich 17.000 g in 4°C fer 1 xtun raus kehool kep. Fer ti Gas1-GFP imunopresipiteere, is te super-weer mit GFP-Trap_A (ChromoTek) in 4°C iwer ti nacht inkexpërt kep. Ti purifitsiert Gas1-GFP woo fon SDS-PAGE ap kexnit kep waar, waar mit Coomassie xtraal blau kefërept kep. Ti Gas1-GFP-Farwe Band is fon te xtraal tirektsioon um te akwedukt rom kexnit kep, un tan, noo alkylatsioon mit yoer asetamid un reduktsioon mit titiotreitol, is in-gel fertiinung mit trypsin kemacht kep. Extrait un trokne tryptixe peptiise un peptiise mit GPI-glikane. Tas trokne peptiit is in 20 μl waser uf kexlos kep. Injekteer een teel (8μl) in te LC. En oktaat-silan-kolone (ODS) is penutst kep fer ti peptiise uner spetsiifixe xtraal kontitsioone se xpaare. Ti mobiil phase is te soltaat A (0,08% fom xwayn) un te soltaat B (0,15% fom xwayn in 80% fom asetonitril). En Accela HPLC-System (Thermo Fisher Scientific, Bostão, Massachusetts) is penutst kep fer ti kholonie mit soltaat A in 55 minute in en xtraal rate fon 50 μl min-1 fer 5 minute eluyeere, un tan is ti konsentratsioon fon soltaat B pis 40% kehoop kep. , Fereenichte Xtaate fon Amërika). Te eluaat waar kontinuierlich in te ESI-Ioon Quel introtuseyert kep, un ti tryptixe peptiise un ti peptiise mit GPI-Klaytung sin torich LTQ Orbitrap XL (hibride lineare ioon trap-orbitrap mass spektrometer; Thermo Fisher Scientific) analysiert kep. In te MS-Setup, waar ti xpanung fon te kapillaare xtraal 4,5 kV, un ti temperatuur fon te transfusioone kapillaare waar 300°C kehal kep. Ti kapillaar xpanung un ti xpanung fon te xlang lins waare uf 15 V un 50 V, respektiif. MS-Data sin in te positiif ioon motiif kriit kep (resolutsioon fon 60.000; mass richtichkheet fon 10 teele pro milioon) in en mass reechle fon 300/m/z mass/last fertiint (m/z) 3000. Ti MS/MS-data sin torich ti ioon trap in te XLsrap uf te eyerxte [Or3] kriit kep. kolëktsioon indutsiert tisosiatsioon (CID)].
MD simulatsioone sin mit te hilef fon te GROMACS (52) Software un MARTINI 2 kraft felt (53-55) kemacht kep. Te CHARMM GUI Membraan Bauer (56, 57) is tan penutst kep fer en tswaayxproochikheet se mache, woo ti DOPC un Cer C18 ore DOPC un Cer C26 enthalung hot. Ti topolokii un ti koordinaate fon Cer C26 sin fon DXCE ap kehool kep, torich ti ekstra peruuf fon te sfingosin xpits. Nuts te protses woo uner pexrip kept fer ti tswaay xprooche se xraywe un se xraywe, tan penuts ti letste koordinaate fom sisteem fer en sisteem se paue woo Emp24 enthalet. Ti transmembraan domain fon te hefe Emp24 (resiste 173 pis 193) is als α-helix konstruiert kep mit te hilef fon te wisioons MD (VMD) tool molekulaare struktur (58). Tan, noo tëm ti iwerxprechung fon te lipide raus kehool kep waar, is tas proot kroos kexnit kep un is in te tswaay sayte kexnit kep mit te hilef fon CHARMM GUI. Tas ën sisteem hot 1202 DOPC un 302 Cer C26 ore 1197 DOPC un 295 Cer C18 un Emp24. Ioniseere tas systeem in en konsentratsioon fon 0,150M. Vier unaafhängiche replikatsioone sin fer tswaay xprooche kompozitsioone kemacht kep.
Ti lipide xpiichelcher sin aus kewaalt kep mit te hilef fom CHARMM GUI protses, woo 405.000 xrit noo runer xtele un tan auskewaalt kewe, woo ti positsioons xrit noo xrit noo runer keen un eliminate, un te tsayt xrit noo runer keet fon 0,005 ps pis 0,02 ps. Noch noo te ëkiliiprum, produtsiert se 6 μs mit en tsayt xrit fon 0,02 ps. Noch noo Emp24 in setse, penuts te selwiche CHARMM GUI protses fer tas sisteem minimiiseere un aus hale, un tan 8 s in te protuktsioon laafe.
Fer ale sisteeme, in te tsayt fom auswënich protses, kept te preserweerungs xrit kontroliert torich te Berendsen-Barostaat (59), un in te protuktsioons protses, kept te preserweerungs xrit torich te Parrinello-Rahman-Barostaat (60) kontroliert. In ale fële, is te xrit noo runer 1 bar un en halpe isotroop xrit noo heyer is penutst kep. Im protses fon te balans un protuktsioon, kept en thermostaat (61) mit xnël rekaliirung penutst fer ti temperatuur fon te protuktsioon fon proote, lipide un soltaate partikele respektiif se koppeere. In te kans operatsioon, is ti tsiil temperatuur 310K. Ti net-petaytungs interaktsioon is ketseelt kep torich en paarichungs list mit te Verlet-Schema mit 0,005 puffer tolerans. Te Coulomb-Term is kexproch kep mit te hilef fom reaktsioons felt un en xnit xtraal fon 1,1 nm. Te Vander Waals term penutst en xtek xtek mit en xtek xtek fon 1,1 nm, un te Verlet xtek xtek is penutst kep fer potensial xtek (62).
Mit VMD, is ti xtek welt lëngte tswixe DOPC-phosphat-peere ore ceramide AM1-peere un te protukt 0,7 nm, un ti kans numer fon lipide woo mit em protukt interakteere, kept ketseelt. Tëm noo ti folkloor formule, rechne mer te ferxwinungs-fertiint (DE) faktor wii in (63): DE faktor = (ti kans numer fon te kanse lipide im proot 0,7) im proot 0,7 (ti kans numer fon te Cer in te kanse lipide) .
Ti pekhante weyert kept als mitkliiter kriit, un ti xprooch xpiile sin fier unaafhängiche kopiie fon SE. Ti statistix petaytung fon te DE-faktoor is torich t-test [(mitel DE-faktoor-1)/SE] kexproch kep. Berechne te P-wert fon te eensichste fertaylung.
Tas GROMACS-Tool is penutst kep fer ti 2D-Lateraal Tichtkheet Karte fom Sisteem woo Emp24 in te letste 250 ns fon te xpuure enthalung hot. Um ti ferkreesung/fertiint karte fon te ceramide se kriin, kept ti ticht karte fon Cer un DOPC keteelt mit te sum fon te karte fon Cer un DOPC, un tan keteelt mit te konsentraatsioon fon Cer im khërper. Ti selwich farp fon te karte is penutst.
Fer ti erkhënung fon te materiaale fer tiise artikel, klikt uf te sayt fon te xprooch fon te layt woo in te xprooch fon te layt xpreche.
Tas is en oone akses artikel woo ferprayt kept uner te pextimte reechle fon te Creative Commons Attribution-Non-Comercial License, woo ti penutsung, ferpraytung un reprotuktsioon in yeete mitel erlaupnis kept, soo lang wii ti ëntxlus net fer komersiaale nutse is un ti premisa is tas ti orikinaal aarwat richtich is. Referëns.
Nootwëntich: Mëyer ferlange ploos tas tuu tayn e-mail adres këpst, tas ti persoon woos tuu ti site recomendast, wees tas tuu wilst tas tii ti e-mail siin un tas es nët spam is. Meyer tuun khee e-mail adresse fange.
Tiise frooch wërt penutst fer se proope ops tuu een pesuucher pist un fer ti automatix spam se ferhëngert.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hooch resolutsioon real-taim pilter tsayche ti importans fon te keramide ketrënke fer ti protuktsioon fon proote in selektiife ausxtëlungs sites.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D hooch resolutsioon real-taim pilter tsayche ti importans fon te keramide ketrënke fer ti protuktsioon fon proote in selektiife ausxtëlungs sites.
©2020 Amerikanixe Assosiatsioon fer ti Forterung fon te Wërter. ale rechte sin reserwiirt. AAAS is a partner of HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef and COUNTER. ISSN 2375-2548.