Presënt *Aktuaal adres: Köln 50931, Taytxlant, Köln Excelëns Kluster Forxung iwer ti xëlwer xtress antwort in krankheete woo mit te altheet se tuun hon (CECAD).
Ti neurodegeneratsioon fon te mitochondriale krankheete kept als irrewersipel aan kesiin, wayl ti metaalixe plastisiteet fon te neurone limiteyert kept, awer te efekt fon te mitochondriale tisfunktsioon uf ti xël autonomii fon te neurone im khërper is xlecht ferxtan kep. Hier, introtuseere mer te xël-spetsiifixe protukt fon Purkinje neurone mit progresiif OXPHOS-defisiëns, woo fon te ferxtorwene mitochondriale fusioons dynamik keproch kept. Meyer hon kefun tas ti mitochondrial tisfunktsioon en tiif ënerung in te protuktsioons xpiichel aus keproch hot, was am ën ti sekwëns fon aktiwiteete fon presëns metaalixe prokrame foer em toot fon te xël kefiert hot. Unkewaart, hon mer ti klaychkheet fon te induktsioon fon te pyruvaat karboksilase (PCx) un anere anti-alter enzyme woo ti intermittënte fom TCA-tsiklus erkhëne, pextimt. Inhiweyerung fon PCx hot te oksiijen stress un ti neurodegeneratsioon ferkreest, was petayt tas ti ateroskleroosis en xitsungs efekt hot in neurone woo OXPHOS ferliire. Ti restauratsioon fon te mitochondrial fusioon in te terminaal ferxwine fon te neurone, tuut tiise metaalixe karakteristike komplet umkeen, un soo, ferhëngert te toot fon te xël. Unser entwiklung identifitseert foer heyer unkeweenliche weech woo ti resiliëns fon te mitochondriale xwiirichkheete pringe un tsayche tas ti neurodegeneratsioon soo kaar in te letste xrit fon te krankheet umkeen khan.
Ti sentral rol fon te mitochondrie in te erhalung fon te neuronale enerjii metaboliismus is pekhant weche te ekstensiif neurolookixe symptoome woo mit te mënxliche mitochondrie krankheete se tuun hon. Ti meyerxte fon tëne krankheete sin fon te xëlcher mutatsioone woo ti mitochondriale xëlwer ekspresioon rekulaariseere (1, 2) ore fon te xëlcher ferxwine woo mit te mitochondriale tiine se tuun hon, woo ti stabiliteet fon te mitochondriale DNA (mtDNA) inerlich petrefe (3, 4). Ti aarwat in tiere modele hot ketsaycht tas, in te antwort uf ti mitochondriale tisfunktsioon in te umlitungs tiskusioon, konserwatiif metaalixe weech (5-7) aktiwiert kewe khëne, was importante informatsioone fer ti tiif ferxtëntnis fon te patogeneese fon tëne komplëxe krankheete pringt. In en xtarek kontrast, unser ferxtëntnis fon te metaalixe ënerunge fon spetsiifixe xëlwer sorte woo fon te alte xwiirichkheete fon te hëmes mitochondriale adenosin trifosfaat (ATP) protuktsioon pextimt sin, is fundamentaal (8), was ti neetichkheet fon te therapeutixe tsiile identifitseere woo penutst kewe khëne fer ti krankheet se ferhëngert ore se ferhëngert, petayte tuut. Ferhëngert ti neurodegeneratsioon (9). Ti informatsioone manktem is tas ti nerwe xëlcher fiil penutst kewe als en kans limiteyert metaalixe flexipiliteet, ferklaycht mit te xëlcher sorte fon umlitungs tiskuse (10). Wën mer aan nëmt tas tiise xëlcher en sentral rol xpiile in te koorteneyerung fon te fersorichung fon metaale fer ti neurone fer ti sinaptix transmissioon se promoweere un antworte uf ti ferxwine un krankheete kontitsioone, is ti kapasiteet fer te xëlcher metaboliismus aanpase an ti ausxprechungs kontitsioone fon te hëmes tiskusioon neekst fer ti glial xëlcher (11-14). Tsum payxpiil, ti inerlich xëlwer heterojeneiteet fon te hëmes tiskusioon, tuut ti xtuutium fon te metaalixe ënerunge woo in spetsiifixe neuronale unerxtitsungs krupe paseere, fiil hinerkeen. Soo, is weenich iwer ti eksakte xëlwer un metaalixe konsekwënse fon te mitochondrial tisfunktsioon in neurone pekhant.
Um ti metaalixe konsekwënse fon te mitochondriale tisfunktsioon se ferxteen, hon mer ti neurone fon Purkinje (PNs) in unerxiitliche xpiichel fon te neurodegeneratsioon isoliert, woo fon te fernichtung fon te mitochondriale auswënich membraan fusioon (Mfn2) keproch kept. Opwool Mfn2 mutatsioone in te mënxe mit en form fon erkhënungs motorixe sentimentaale neuropatii ferpun sin, woo als Charcot-Marie-Tooth tiwersiteet pekhant is (15), is ti konditsioons fernichtung fon Mfn2 in te miise en kuut erkhënt induktsioon fon te oksiitatsioons fosforylatsioon (OXthoPHOS) tisfunktsioon. Ti ferxiitne neuronale subtipe (16-19) un te resultaat fon te neurodegeneratiif fenomeen sin mit progresiif neurolookixe symptoome pegleet kep, wii ti xwiirichkheete fon te xwiirichkheete fon te xwiirichkheete (18, 19) ore cerebellar ataxia (16). In te penutsung fon en kombinatsioon fon etiket-frei kwantitatiif (LFQ) protuktsioons methooke, metabolomik, imaterial, un virolookixe methoote, tsayche mer tas ti protuktsioon fon te neuro-degeneratsioon xtarek ti pyruvaat karboksilase (PCx) un anere faktoore woo in te arterioskleroose fon PNs in vivo tepay sin, influëntsiert kept. Fer ti relewans fon tee entwiklung se ferxteen, hon mer spetsiifix ti ekspresioon fon PCx in Mfn2-defitsiente PNs runer kexmis, un hon kefun tas ti operatsioon ti oksiijen xtress ferxlimert hot un ti neurodegeneratsioon ferxlimert hot, was soo pewayst hot tas ti azoospermii ti xël toot Metabolixe aanpasungs kapasiteet fertiint. Xlim ausxprechung fon MFN2 khan ti terminaal degeneratsioon PN komplet retuer pringe mit xlim OXPHOS-defisiëns, massive konsum fon mitochondrial DNA, un ansichtlich ferprochne mitochondrial network, was noch mee petayte khan tas tiise form fon neurodegeneratsioon sich soo kaar in te forterungs xtel fon te xël krankheet erhole khan.
Um ti mitochondrie in Mfn2 knockout PNs se visuaaliiseere, hon mer en muus xtam penutst woo ti Cre-afhanklichkheet fon te mitochondrie erlaupnis kept fer ti xlimste fluoresëns protukte (YFP) (mtYFP) (20) Cre ausxprechung se xpiire un ti mitochondrie morfolokii in vivo kontroliert. Meyer hon kefun tas ti fernichtung fom Mfn2-Ken in PNs pis an ti xrit noo xrit ti mitochondrial network nëme teet (Figura S1A), un ti friirix ënerung is in 3 woche kefun kep. Im keeche teel, ti substansiaal ferxwinung fon te PN-Xel Layer, wii ti ferlust fon te Calbindin-Imunofluoresëns, hot net aankefang pis 12 woche alt (Figura 1, A e B). Ti tsayt unerxiit tswixe te friirixe ënerunge in te mitochondrial morfolokii un te sicher aanfang fom neurone toot hot uns uf kemuut fer ti metaalixe ënerunge woo fon te mitochondrial tisfunktsioon aus keproch kep sin foer te xël toot, unersuuche. Meyer hon en fluoresëns-aktiwiert xël sorteere (FACS)-basiert strateejii entwikkelt fer YFP (YFP+)-expresioon fon PN isoleere (Fikuur 1C), un in kontrol mikratsioone (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), woo hier CT1BRL kenënt kept (Fikuur 1C). Ti optimiseerung fon te xprooch strateejii woo uf te relatiif intensiteet fom YFP-Signaal basiert, erlaupnis fer ti YFP+-Kërper (YFPhigh) fon PNs fon net-PNs (YFPneg) (Fikuur S1B) ore putatiif fluoresëns axon/dendrite fraktsioone (YFPlow; mikrofikuur S1D, konfokonfirmiert fon mikrofikuur S1D, links), reiniche. Um ti itentiteet fon te xprooch populatsioon se ferxteen, hon mer LFQ-proteomik un tan ti haupste komponënte analyse kemach, un hon kefun tas es en klaare separatsioon kept tswixe YFPhigh un YFPneg-xpiichle (Figura S1C). YFPhigh xëlcher hon en net-ferkreesung fon te pekhante PNs marker ketsaycht (woo Calb1, Pcp2, Grid2 un Itpr3 sin) (21, 22), awer khee ferkreesung fon protukte woo kewoonlich in neurone ore anere xëlcher aus kexproch kewe (Figura 1D) ). En ferklaychung tswixe protukte in klassifitseerte YFPhigh xëlcher woo in unerxiitliche xprooche kesammelt kep sin, hot en korrektsioons koefitsiënt > 0,9 ketsaycht, was ti kuut reprotuktsioons kapasiteet tswixe ti biolookixe replikatsioone tsaycht (Figura S1E). In te resumatsioon, hon tiise data unser plans fer akute un spetsiifixe isolatsioon fon realisatsioons PN valitiert. Wayl tas L7-cre xpiiler systeem woo penutst kep waar, ti mosaik rekombinatsioon in te eyerxte woche noo em ën fom leewe indutsiert (23), hon mer aankefang ti miite fon te CTRL un konditsioone (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Neurone se samele. Noo tëm ti rekombinatsioon fërtich is, kept es Mfn2cKO in 4 woche alt. Als ën phunkt, hon mer 8 woche alt kesuucht, woo ti PN-laytung intakt waar, troknt ti klaychkheet fon te mitochondria fraktsioon (Figura 1B e Figura S1A). In te kans welt hon mer inkexpërt 3013 protukte, fon woo ungefeer 22% fon te MitoCarta 2.0 anotatsioone pextimt kep sin, woo uf em mitochondrie protukt als mitochondrie (Figura 1E) (Figura 1E) (24) pextimt kep sin. Ti tiferensiaal xprooch ekspresioon analyse woo in te woch 8 kemacht kep waar, hot ketsaycht tas ploos 10,5% fon ale protukte ti sientifik ënerunge hate (Figura 1F un Fikuur S1F), fon woo 195 protukte runer kexnit kep sin un 120 protukte uf kexnit kep sin (Figura 1F). Es is important se wise tas ti “inwanerungs weech analyse” fon tëm dataset tsaycht tas ti tiferensiaal ausxprechung fon te jeneetik hauptseechlich tsu en rexpektabel set fon spetsiifixe metaalixe weech keheert (Figura 1G). Interessant is tas, opwool ti down-rekularisierung fon te weech woo mit OXPHOS un kalsium signaale se tuun hon, ti influëns fon te mitochondriale tisfunktsioon in fusioons-defitsiente PNs konfirmiert, anere kateeoriie woo hauptseechlich te amino asiate metaboliismus influëntsiire, sin signifikant uf kexpant kep, was in linie is mit te metaboliismus woo in mitochondrial konwiring PN paseyert. disfunktsioon.
(A) Representatiiwe konfokaale foerxtelunge fon cerebral sektsioone fon CTRL un Mfn2cKO mikratsioone woo progresiif ferlust fon PNs tsayche (kalbindiin, xwayn); kerne waar mit DAPI kontripuytsioon. (B) Kwantifikatsioon fon (A) (een-wayl analyse fon te warianse, ***P<0,001; n = 4 pis 6 krupe fon tray miise). (C) Eksperimentaal aarwayt. (D) Heete karte fertaylung fon marke spetsiifixe fer Purkinje (hier) un anere xël sorte (mitte). (E) Venn-diagram woo ti kans numer fon te mitochondriale protukte woo in te xprooch fon te PN identifitsiert kep sin, tsaycht. (F) Vulkaan ploos fon teferensiaal ausxprechung fon protukte in Mfn2cKO neurone in 8 woche (sicherheets xnit-wert fon 1,3). (G) Ti kreatiwiteet weech analyse tsaycht ti 5 importanteste uf-rekulaar (rot) un runer-rekulaar (blau) weech in te Mfn2cKO PN woo als 8 woche klassifitseert kep sin. Te tswixichne ausxprechungs niwel fon yeete entfërnungs proot is ketsaycht kep. Grauskala hitte karte: aanpast P-wert. ns, nët wichtich.
Proteomik data hon ketsaycht tas ti proote ekspresioon fon te komplëxe I, III un IV sich wayter ferkreest hot. Ti komplëxe I, III un IV hon al ësensiaale mtDNA-kotike unerxtitsung kriit, wën te komplëks II, woo ploos nuklear-kotike waar, waar im xlisel net petrof kep (Figura 2A un Fikuur S2A). . Konsistent mit te protuktsioons resultaate fon te proteomik, hot ti imunohistokemii fon te cerebral tiskusioons sektsioone ketsaycht tas te MTCO1 (mitochondrial citokrom C oksidase subunit 1) subunit niwel fon te komplëks IV in PN graduelt runer kang is (Figura 2B). Ti mtDNA-kotiert unerxtitsung Mtatp8 waar signifikant ferkreest kep (Figura S2A), wën te stabiliteet niwel fon te nuklear-kotiert ATP-sintase unerxtitsung net ferënert kep waar, was konsistent is mit te pekhante staapel ATP-sintase unerxtitsung F1 komplëks, wën ti mtDNA-expresioon staapel is. Ti formatsioon is konsistent. Unterxpreche (7). Evaluatsioon fon te mtDNA niwel in te sorte Mfn2cKO PNs torich ti polimerase ketrënk reaktsioon in real tsayt (qPCR) hot ti xrit noo runer fon te mtDNA kopie numer pekhant kemach. Im ferklaych mit te kontrol krupe, in 8 woche, waare ploos 20% fom mtDNA niwel kehal kep (Figura 2C). Konsistent mit tëne resultaate, is ti konfokaal mikroskopii farwe fon Mfn2cKO PNs penutst kep fer ti DNA se fine, was ti tsayt-afhanklich konsum fon mitochondriale nukleotiide tsaycht (Figura 2D). Meyer hon kefun tas ploos welche kanditaate woo in te mitochondrie protuktsioon un stress antwort influëntsiert kep sin, uf kehoop kep sin, tepay Lonp1, Afg3l2 un Clpx, un OXPHOS komplëks montaaj faktoore. Keweenliche ënerunge in te niwele fon te protuktsioon fon protukte woo in te apoptoos influëntsiert kep sin, sin net kefun kep (Figura S2B). Tas selwiche, hon mer kefun tas ti mitochondrie un ti endoplasma retikulum kanale woo in te kalsium transport influëntsiert kewe, ploos kleene ënerunge hon (Figura S2C). Tsum payxpiil, ti evaluatsioon fon te autofagie-relatsioons protukte hot khee signifikante ënerunge kefun, was konsistent is mit te sicherheet fon te autofagosome woo in vivo torich imunohistokemii un elektroon mikroskopii peopacht kep sin (Figura S3). Awer, ti progresiif OXPHOS-disfunktsioon in PNs is mit klaych ultrastrukturaale mitochondriale ënerunge pegleet kep. Mitochondriaale krupe sin in te xëlcher khërwer un in te dendrite peem fon Mfn2cKO PNs in te elter fon 5 un 8 woche kesiin kep, un ti inerlich membraan struktur hot tiif ënerunge mit kemach (Figura S4, A e B). Konsistent mit tëne ultrastrukturaale ënerunge un en simpoolix ferklaychung fon mtDNA, hot ti analyse fon akute serebraale xlisel xlisel mit tetrametilrodamin metil ester (TMRM) ketsaycht tas te mitochondrial membraan potensial in Mfn2cKO PNs signifikant ferklaychung waar (Figura S4C).
(A) Ti tsayt xrit analyse fon te ausxprechungs niwel fon OXPHOS komplëks. Ploos ti protuktsioon fon proote mit P<0,05 in 8 woche (tswaay-wayl ANOVA). Punkte linie: Keen aanpasung im ferklaych mit CTRL. (B) Links: Een payxpiil fon een cerebral sektsioon woo mit anti-MTCO1 antikörper markiirt kep is (xkala xtraal, 20 μm). Ti area woo fon Purkinje xëlcher pewoont kept, is mit keel kexnit kep. Rechts: Kwantifikatsioon fon te MTCO1 niwele (een-wayl analyse fon te warianse; n = 7 pis 20 xtele fon tray miise analysiert). (C) qPCR-analyse fon mtDNA-kopie numer in te sorte PN (een-wayl analyse fon te warianse; n = 3 pis 7 miise). (D) Links: Een payxpiil fon een cerebral xpits puuch woo mit een anti-DNA-antikörper markiirt kep is (xkala xpits, 20 μm). Ti area woo fon Purkinje xëlcher pewoont kept, is mit keel kexnit kep. Rechts: Kwantifikatsioon fon mtDNA-Lësioon (een-wayl analyse fon te warianse; n = 5 pis 9 xëlcher fon tray miise). (E) Een payxpiil fon een akute cerebral sektsioon woo ti mitoYFP + Purkinje xëlcher tsaycht (pfeil) in een kans xëlcher patch klamp opname. (F) Kwantifikatsioon fon IV kurwe. (G) Representatiiwe opjëkte fon te xpiichle fon te xpiichle in CTRL un Mfn2cKO Purkinje xpiichle. Top trace: Te eyerxte puls woo AP aus keproch hot. Uner xpuur: Maximal AP frekwëns. (H) Kwantifikatsioon fon te pos-sinaptixe spontaane influënse (sPSPs). Ti representatiif opjektiif xpuure un sayn zoom fertiint sin in (I) ketsaycht kep. Een-wayl analyse fon te warianse hot n = 5 pis 20 xtele fon tray miise analysiert. Ti data sin aus kexproch wii mittel±SEM; *P<0,05; **P<0,01 tas; ***P<0,001 tas. (J) Representatiiwe xpuure fon spontaane AP kexrip mit te hilef fon te perfëkt patch klamp modus. Top xpur: Maximal AP frekwëns. Under spour: zoom fon een eensichste AP. (K) Kwantifitseere ti tswixich un maximaal AP-frekwëns noo (J). Test fon Mann-Whitney; n = 5 xëlcher sin fon fier miise analysiert kep. Ti data sin aus kexproch wii mittel±SEM; nët wichtich.
Klaych OXPHOS xwiirichkheete sin in te 8 woche alt Mfn2cKO PN kefun kep, was tsaycht tas ti fisiolookix funktsioon fon te neurone xlim anormaal is. Tesweche, hon mer ti pasiwe elektrixe kharakteristike fon te OXPHOS-defitsiente neurone in 4 pis 5 woche un 7 pis 8 woche analysiert, torich ti kanse xëlcher patch klaytungs opjektiife in akute cerebellar xlisel (Figura 2E). Unkewaart, te tswixe rutxiche membraan potensial un influëns resistens fon Mfn2cKO neurone waare ëkstra fer ti kontrol, opwool es subtiile unerxiite tswixe te xëlcher kept (Taatel 1). Tas selwiche, in 4 pis 5 woche, waare khee xlechte ënerunge in te xtroos-xpanungs relatsioon (IV kurwe) kefun kep (Figura 2F). Awer, khee Mfn2cKO neurone fon 7 pis 8 woche alt hon tas IV-Rejiim (hiperpolarisatsioons xrit) iwerleept, was tsaycht tas es en klaare sensiiwliteet kept fer ti hiperpolarisatsioons potensial in tiise letste xrit. Im keeche teel, in Mfn2cKO neurone, ti depolarisatsioons xtroose woo repetitsioons aktsioons potensial (AP) aus xtërwe, sin kuut torich kefaar, was petayt tas tëne sayn kanse ausxtëlungs methooke net signifikant anere sin wii tii fon 8 woche alt kontrol neurone (Taatel 1 un Fikuur 2G). Tas selwiche, ti frekwëns un amplituut fon spontaane postsynaptixe xtroose (sPSCs) waare ferklaychbar mit tëne fon te kontrol krupe, un ti frekwëns fon te ewënte is fon 4 woche pis 5 woche pis 7 woche pis 8 woche mit en ëkstra ferkreeserung kewakst (Figura 2, H e I). Ti tsayt fon te sinaptix rayfe in PNs (25). Similiare resultaate waare noo perfëkt PNs plets kriit. Tiise konfiguratsioon ferhëngert ti meechlich kompënsatsioon fon te xëlwer ATP-fektsioone, wii es in te kans xëlwer patch klamp opjetiiw pasiire khan. Im spetsiaale, waare ti rutxiche membraan potensial un ti spontaane xpiirungs frekwëns fon Mfn2cKO neurone net petrof kep (Figura 2, J e K). In te resumatsioon, tiise resultaate tsayche tas PNs mit klaychmeesiche OXPHOS-disfunktsioon kuut mit hooche frekwënse ausxtëlungs methooke um keen khëne, was tsaycht tas es en kompënsatsioons mechanisme kept woo se erlaupnis kept fer neekst normaale elektrofisiolookixe antworte hale.
Ti data sin aus kexproch kep als mittel ± SEM (een-wayl analyse fon te warianse, Holm-Sidak sayn multiplitseyert ferklaychungs test; *P<0,05). Ti eenheet numer is torich klaytung ketsaycht.
Meyer hon uns foer kexlaa fer se unersuuche op yeete katee in te proteomik dataset (Figura 1G) ti weech inkluut woo ti xlimste OXPHOS-defisiëns entfëre khëne, un soo, erkhëne mer warom ti petrofente PN ti neekst normaal elektrofisiolokii hale khëne (Figura 2, E pis K). . Proteomik analyse hot ketsaycht tas ti enzyme woo in te katabolismus fon te ferpintungs ketrënke amino asiate (BCAA) tepay sin, signifikant uf kehoop kewe (Figura 3A un Fikuur S5A), un tas te ën protukt asetil-CoA (CoA) ore suksinil CoA khan ti trikarboksilaate in te arterioskleroose erkhëne. Meyer hon kefun tas te inhalt fon te BCAA-transmisioon 1 (BCAT1) un BCAT2 sich tswaay ferkreest hot. Tii katalyseere te eyerxte xrit fon te BCAA-katalys, torich ti xpiirung fon glutamat fon α-ketoglutaraat (26). Al ti unerxtitsungs eenheete woo ti fertaylungs ketrënke fon te keto asiat dehydrogenase (BCKD) komplëks mache, sin uf kexpant kep (te komplëks katalyseyert ti nookhomer un irrewersipel dekarboksilatsioon fon te resultaate fon te BCAA-koolbon xkeleet) (Figura 3A un Fikuur S5A). Awer, es kept khee klaare ënerunge in te BCAA selepst in te sorte PN kefun, was khan sin tas ti xëlwer uf nëmung fon tëne ësensiaale amino asiate ore ti penutsung fon anere xpiichle (glukose ore laktose) fer te TCA-tsiklus erkhëne (Figura S5B). PNs woo OXPHOS ferloer hon, hon aach en ferkreest glutamin ferpintung un transmisioon aktiwiteete in 8 woche ketsaycht, was sich reflekteyert khan torich ti uf-rekularisierung fon te mitochondriale enzyme glutaminase (GLS) un glutamin pyruvaat transmisioon 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Es is important se wise tas ti uf-rekularisierung fon GLS sich ferpint mit te xpiichle fon te isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ti ënerung fon Mfn2cKO/CTRL is unkefeyer 4,5-fache, P = 0,05), un sayn spetsiifixe uf-rekularisierung in kanser tiskuse Kan mitochondriale unerxtitse. (27).
(A) Ti hits khaart tsaycht ti falx ënerung in te proot niwel fer ti pextimte weech in 8 woche. (B) Eksemplo fon een cerebral xlisel woo mit anti-PCx antikörper markiirt kep waar (xkala xtek, 20 μm). Te keel xpits puuch tsaycht te Purkinje xël khërper. (C) Ti tsayt xrit protuktsioons analyse identifitseert als en important kanditaat fer ti ateroskleroose (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 miise). (D) Uf tëm pilt: En xkemaatixe diagram woo ti unerxiitliche aate tsaycht fer ti etikeete fon te karbon in te [1-13C]pyruwaat traywer enthalung (woo, torich PDH ore trans-arterial weech). Uner: Ti violin xtel tsaycht te prosentxaft fon te eensichste marke fon kolt (M1) woo in aspartak, sitrun un apxlus konwerteyert kep waar noo em marke fon akute cerebral xlisel mit [1-13C]pyruwaat (paar t-test; ** P <0,01). (E) Umfasent tsayt kexicht analyse fon te inkexripne weech. Ploos proote mit P<0,05 in 8 woche . Xtraal xtraal: khee aanpasungs weyert (tswaay-wayl analyse fon te warianse; * P <0,05; *** P <0,001). Ti data sin aus kexproch wii mittel±SEM.
In unser analyse, is te BCAA-katabolismus eene fon te xlisel uf-rekularisierungs weech kep. Tas fakt tsaycht xtarek tas te ventilatsioons volumin woo in te TCA-Klaytung rin keet, khan in PN ferënert kewe woo OXPHOS ferliert. Tas khan en kroos form fon neuronale metabolixe rexpekt representeere, woo en tirekt influëns hon khan uf ti neuronale fisiolookii un iwerleepung iwer ti erhalung fon xlim OXPHOS tisfunktsioon. Konsistent mit tee hypothees, hon mer kefun tas te haupste anti-aterosklerootixe enzym PCx uf kexpant kept (Mfn2cKO/CTRL ënert sich unkefeyer 1,5 mool; Fikuur 3A), was ti konwersatsioon fon pyruvaat in oxaloasetat katalyseyert (28), woo ti tissue in te brain a2000 sin. 30). Konsistent mit te proteomik resultaate, hot ti konfokaal mikroskopii ketsaycht tas ti PCx ekspresioon spetsiifix un signifikant ferkreest kep waar in OXPHOS-defitsiente PNs, wën ti PCx reaktsioon hauptseechlich fer ti neekste Bergmann glial xëlcher fon te kontrol pextimt kep waar (Figura 3B). Fer ti peopachtung fon te PCx funktsiooneere, hon mer akute cerebral xlisel mit [1-13C]pyruwat tracer pehantelt. Wën te piruwat torich ti piruwat dehydrogenase (PDH) oksiiert kep waar, is sayn isotoop etiket ferxwun , Awer is in te TCA-tsiklus intermittënte inkexrip kep wën te piruwat torich vaskulaare reaktsioone metaboliseyert kept (Figura 3D). In te unerxtitsung fon unser proteomik data, hon mer en kroos numer fon marker fon tëm tratitsioons xpiichelcher in te aspartak xpiichelcher fon Mfn2cKO xpiichelcher ketsaycht, wën mer aach en moter xpiichelcher un ti apteelungs xpiichelcher aach en moter xpiichelcher hate, opwool net signifikant (Figura 3D).
In te dopamin neurone fon MitoPark miise mit mitochondrial tisfunktsioon woo fon te dopamin neurone spetsiifix fernichte te mitochondrial transkriptsioons faktor A (Tfam) (Figura S6B), waar ti PCx ekspresioon aach signifikant uf-rekularisiert kep (31), was tsaycht tas ti aseton asiat tisfunktsioon fon te arterioskleroose is OXFOS im khërper. Es is important se wise tas es kefun kep is tas unike enzyme (32-34) woo in neurone aus kexproch kewe khëne, woo mit arterioskleroose se tuun hon, sin signifikant uf kehoop kep in PNs woo OXPHOS ferliire, wii ti propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA mitochilCoA konwerteere in propionil-CoA-Malonyl-CoA konwerteere in . enzym 3 (ME3), woo ti haupst rol fon te piruwaat fon te malaat rekuperatsioon is (Figura 3, A e C) (33, 35). Tsum payxpiil, hon mer en sicher ferkreeserung fom Pdk3 enzym kefun, woo PDH fosforyliert un soo inaktiwiert (36), wën mer khee ënerunge in te Pdp1 enzym woo PDH aktiwiert ore im PDH enzym komplëks selepst kefun hot (Figura 3A). Konsekwent, in Mern2cKO PNs, waar ti fosforylatsioon fon te α1-unerxiitliche α (PDHE1α)-unerxiitliche ërepxafte fon te pyruvat-dehydrogenase E1-komponënt fon te PDH-komplëks in Ser293 (woo pekhant is fer ti enzym aktiwiteet fon PDH inhiweyere) ferkreest kep ( Fikuur S6C) (Fikuur S6). Piruwat hot khee vaskulaar akses.
Tsum xlus, hon mer kefun tas te super-weech fon te seriin un glisiin biosintesis, te ferwante mitochondrial folaat (1C) tsiklus un ti prolin biosintesis (Figura 1G un Fikuur S5C) sin al signifikant uf kehoop kep, noo te pekhante, iwer te aktiwiteet protses. Ti umlitungs tiskusioone sin mit mitochondriale tisfunktsioon aktiwiert kep (5-7). Konfokaal analyse woo tiise protuktsioons data unerxtitst, hot ketsaycht tas in PN mit OXPHOS ferloer, ti cerebral xlisel fon 8 woche alt mikratsioone, woo ti seriin hydroksimetiltransferase 2 (SHMT2) unerxtitst kep waar, en xlisel enzym fom mitochondrial folaat tsiklus. Sicherheets imuniteet (Figura S5D). In 13 CU-glukoos-inkubierte akute cerebral xlisel, hon metaalixe tratitsioons eksperimente noch mool ti uf-rekularisierung fon te seriin un prolin biosintesis pekhant kemach, was petayt tas te flus fon karbon isoforme in seriin un prolin sich ferkreest hot (Figura S5E). Wayl ti reaktsioone woo fon GLS un GPT2 promoweyert kewe, sin ferantwortlich fer ti sintesis fon glutamat fon glutamin un ti transmisioon tswixe glutamat un α-ketoglutaraat, sayn ufpasung tsaycht tas OXPHOS-defitsiente neurone en ferkreest nachparxlayt hon fer glutamat , Tas khan sin tas ti ferkreest pro-sintesis fon te pro-sintesis fon te protuktsioon fon te protuktiwiteet fon te protuktsioon fon te protuktsioons xpiichel fon te protuktsioon fon te protuktsioons xpiichel fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktsioon fon te protuktiwiteet fon te protuktsioon fon te protuktsioons methooke). Im keeche teel fon tëne ënerunge, hot en proteoomixe analyse fon te cerebral astrotsiite fon PN-spetsiifixe Mfn2cKO-mitel ketsaycht tas tiise weech (inklusiif ale antioksiiante) sich net signifikant ferënere in te ekspresioon, was tsaycht tas Ti metaalixe rexpekt selektiife is fer ti ferxwine fon PN pis G, G. S6).
In te resumatsioon, hon tiise analyse signifikant unerxiitliche mustere fon te tsaytliche aktiwiteete fon spetsiifixe metaalixe weech in PNs ketsaycht. Opwool ti anormaale neuronale mitochondriale funktsioone pis friirixe ateroskleroose un 1C remodelung pringe khëne (Figura 3E un Fikuur S5C), un soo kaar ti foerxtelunge fon te ënerunge in te ekspresioon fon I un IV komplëxe, sin ti ënerunge in te serine de novo sintesis ploos Es is ploos in te letste stages taytlich kep. OXPHOS-disfunktsioon (Figura 3E e Figura S5C). Ti entwiklungs xpiirunge definiere en sekwëns protses woo ti stress-influëns mitochondria (1C-siklus) un ti sitoplasma (seriin-biosintesis) antworte, woo sinerjix sin mit te ferkreesung fon te ateroskleroose in te TCA-siklus, fer te neuronale metabolisme noch mool se forme.
woche alt OXPHOS-defitsiente PNs khëne ti hooch frekwëns fon te eksitatsioons aktiwiteete hale un en simpoolix metaalixe rekonnektsioon uner keen fer ti mitochondrial tisfunktsioon kompenseere. Ti entwiklung pringt en interesante meechlichkheet uf tas soo kaar in tëm momënt, tiise xëlcher khëne aach therapeutixe interwentsioone kriin fer ti neurodegeneratsioon ferxpeete ore ferhëngert. Xpeet. Meyer hon tiise meechlichkheet torich tswaay unaafhängiche interwentsioone resolweyert. In te eyerxte methook, hon mer en Cre-afhanklich adeno-assotsiiert virus (AAV) kexrip, tas MFN2 selektiif aus kexproch kewe khan in OXPHOS-defitsiente PNs in vivo (Figura S7A). Ti AAV woo MFN2 kotifitseere un te fluoresënt reporter xën mCherry (Mfn2-AAV) sin in priimer neurone kultuure in vitro fersichert kep, was ti MFN2 in en Cre-afhanklich aat aus kexproch hot un ti mitochondrial morfolokii retuer pringt, was ti neuromutatsioon in Mfns, B Fikuur S7 ferhëngert hot ( D, B Fikuur S7). Als neekst, hon mer in vivo eksperimente kemach fer stereotaktix 8 woche alt Mfn2-AAV in te cerebral korteks fon Mfn2cKO un kontrol mikratsioone, un hon 12 woche alt mikratsioone analysiert (Figura 4A). Ti tratamënt fon Mfn2cKO-miise sin kextorep (Figura 1, A e B) (16). Virale transtuktsioon in vivo hot selektiife ausxprechunge fon PN in ëtliche cerebral krupe ketsaycht (Figura S7, G e H). Ti injektsioon fon te kontrol AAV woo ploos mCherry aus xprecht (Ctrl-AAV), hat khee signifikante efekt uf te xpiichel fon te neurodegeneratsioon in Mfn2cKO tiere. Im keeche teel, ti analyse fon Mfn2cKOs woo mit Mfn2-AAV transtutsiert kep sin, hot en simpoolix protektsioons efekt fon te PN-Xel Layer ketsaycht (Figura 4, B e C). Im xtant, ti neurone tichtkheet xteet xon neekst unerxiitliche fon te kontrol tiere (Figura 4, B un C, un Fiktsioon S7, H un I). Ti ekspresioon fon MFN1 awer net MFN2 is ti selwiche effektiif in te retung fon te neuronale toote (Figura 4C un Fikuur S7, C un F), was tsaycht tas ti ekspresioon fon ektopixe MFN1 ti manktum fon MFN2 effektiif erkhëne khan. Witer analyse uf em eensiche PN niwel hot ketsaycht tas Mfn2-AAV ti ultrastruktur fon te mitochondrie fer ti kans welt retuer pringt, ti mtDNA niwele normaliseyert, un ti hooch ekspresioon fon te anti-angiogenesis marker PCx ​​umkeen (Figura 4, C pis E ). Ti wisioon inspektsioon fon te keretne Mfn2cKO-Mënxe in en rutxich xtaat hot ketsaycht tas sayn haltung un motorixe symptoome (peweechung S1 pis S3) sich ferpesert hon. In te xlus, tiise eksperimente tsayche tas ti ferxpeetung fon te reintrotutsioon fon MFN2 in PNs woo xlim defisiënt sin in OXPHOS, kenuuch is fer te mtDNA konsum umkeen un ti ateroskleroose influëntsiire, was ti axon degeneratsioon un te neuronale toot in vivo ferhëngert.
(A) En xkema woo ti eksperimentaal xtel tsaycht fer ti influëns fon AAV woo MFN2 kotifiert, wën te inkexripne metaalixe weech aktiwiert kept. (B) Representatiiwe konfokaale pilter fon 12 woche alt cerebral xlisel woo in 8 woche in Mfn2cKO miise transtutsiert kep sin un mit anti-Kalbindin antikörper markiert kep sin. Rechts: Skala fon axon fibre. Ti xpiichel fon te axon zoom is 450 un 75 μm. (C) Links: Kwantifikatsioon fon te Purkinje-Xel Tichtkheet in te AAV-Trans-Krupe (AAV+) (een-wayl analyse fon te warianse; n = 3 miise). Rechts: mtDNA-fokus analyse in transfutsyoon PN in te woch 12 (unpaar t-test; n = 6 xëlcher fon tray miise). * P <0,05; ** P <0,01 tas. (D) Representatiiwe transmisioon eletroone mikrokrafe fon PNs fon Mfn2cKO cerebral sektsioone woo mit te inkexripne virale vektore transtutsiert kep sin. Ti rosa mask iluustreert te plats woo ti dendrite pewoont hon, un te keel punkte iluustreert te zoom woo uf te rechts sayt foer kextëlt kept; n representeert te kern. Skala xteen, 1μm. (E) tsaycht een payxpiil fon PCx-fërtichkheet in PN transtutsiert in 12 woche. Skala xteen, 20μm. OE, iwerxprechung; FC, falt ënerung.
Tsum xlus, hon mer ti importans fon te peroxidase-influëns xëlwer iwerleepung in PNs woo OXPHOS-disfunktsioon erleept hon, unersuucht. Meyer hon mCherry-kotifiert AAV-shRNA (kurt xpits puuch RNA) kexrip woo spetsiifix fer ti PCx mRNA fon te muus (AAV-shPCx) kexrip kep waar, un hon te virus ore sayn xraay kontrol (AAV-scr) in te cerebel fon Mfn2cKO miise inkexpritst. Ti injektsioon waar in te fierte woch fon te elter kemacht kep (Figura 5A) fer ti efisiëns fon te PCx knoop in te tsayt woo ti PCx ekspresioon sich ferkreest hot (Figura 3C) un ti PN-Xel Layer noch intakt waar (Figura 1A). Es is important se wise tas ti PCx runer xmayse (Figura S8A) en simpoolix akseleratsioon fon te PN-Toot, woo in te infektsioons ring limiteyert kept (Figura 5, B un C). Um te mechanisme fon te metaalixe efekte woo fon te PCx uf-rekularisierung influëntsiert kep sin, hon mer te redoks-status fon PNs noo PCx-knockdown xtuteyert un AAV-petaytungs optikaal biosensor Grx1-roGFP2 sin simultaan aus kexproch kep (Figura S8, B pis D) fer ti glutathioon fon te relatiif peptiit3 ewalyeere. Tan, hon mer tswaay-fotone fluoresëns leewens tsayt imaterial mikroskopii (FLIM) in akute hëmes xlisel fon 7 woche alt Mfn2cKO ore kontrol liter mates kemacht, fer ti potensial ferënerunge in te sitoplasmatik redoks status noo te ferifikeerung fon FLIM kontitsioone (Figura S8, E pis G). Ti analyse hot en sicher ferkreeserung fom oksiitatsioons xtel fon en eensichste Mfn2cKO PNs woo PCx ausxprechung ferliert, was anerxter is wii ti kontrol neurone ore Mfn2cKO PNs woo ploos xraayeray shRNA aus xpreche (Figura 5, D e E). Wën ti PCx ausxprechung runer-rekularisiert kep waar, hot te prosentxaft fon Mfn2cKO PNs woo en hooch oksiijen xtel ketsaycht hon, mee wii tray mool kewakst (Figura 5E), was tsaycht tas ti PCx-op-rekularisierung ti redoks kapasiteet fon te degenerierte neurone erhalt hot.
(A) En xkema woo ti eksperimentaal xtel tsaycht fer ti influëns fon AAV-kotifitseere shPCx wën ti inkexripne metaalixe weech aktiwiert kept. (B) Representatiiwe konfokaale foerxtelunge fon 8 woche alt cerebral sektsioone in Mfn2cKO mikratsioone transtutsiert un markiert mit anti-kalsineurin antikörper in 4 woche. Skala xteen, 450μm. (C) Kwantifikatsioon fon te Purkinje-Xel Tichtkheet in AAV-Trans-Krupe (Een-wayl analyse fon te Waranse; n = 3 pis 4 miise). Ti data sin aus kexproch wii mittel±SEM; ***P<0,001 tas. (D) Representatiif FLIM pilt tsaycht ti tswixe leewens tsayt fon 7 woche alt PN woo te glutathioon redoks sensor Grx1-roGFP2 aus xprecht uner te pextimte xpiiriche kontitsioone. LUT (sich-op-tafel) fertiint: iwerleepungs tsayt interwal (in pikosekunte). Skala xteen, 25μm. (E) Te histogram tsaycht ti fertaylung fon te Grx1-roGFP2 leewens mitel fon (D) (n=158 pis 368 xëlcher in tswaay miise uner yeete kontitsioon). Ti xpits puuch xpits iwer yeete histogram: tsaycht ti kans numer fon te xpitse mit signifikant mee (rote, oksiijen) ore khortse (ways, xpits puuch) leewens tsayt weyert, woo 1 SD fon te tswixe leewens tsayt weyert in CTRL-AAV-scr iwertrefe. (F) Te propoos model tsaycht te xitsungs efekt fon te upregulatsioon fon neuronale PCx.
In te kans welt, ti data woo mer hier foer pringe, tsayche tas ti re-ekspresioon fon MFN2 ti forterung fon te PN komplet retuer pringe khan mit xlim OXPHOS-defisiëns, xlim mtDNA-petaytung, un ekstreem anormaal ista-wii-morfolokii, was ti kontinuiteet fon te forterung soo kaar in forterungs krankheete pringt. Neurodegeneratsioon kept rewersipel pewaysunge fon te xtel foer te toot fon te xël. Tiise xpiichel fon metaalixe flexipiliteet kept noch mool pekhant kemach torich ti kapasiteet fon te neurone fer ti ateroskleroose influëntsiire (en rexpekt fer ti TCA-Krankheit), was ti PCx ekspresioon in PNs woo OXPHOS ferliire, inhiweyert un ti xël toot ferkreest, was en protektsioons rol xpiilt (Figura 5F).
In tee xtuutium hon mer pewaysunge kep tas ti antwort fon PNs uf OXPHOS tisfunktsioon is ti xrit noo xrit konwerteyert fon te TCA-tsiklus ateroskleroose torich te tiferensiaal aktiwiteet weech woo fon metaalixe prokrame aktiwiert kept. Meyer hon ti proteomik analyse mit fiile komplët methoote pekhant kemach un hon ketsaycht tas wën se fon xlim mitochondriale xwiirichkheete aus keproch kewe, ti neurone en foer heyer unkeweenlich form fon metaalixe elastisiteet hon. Fer unser ferwunere, te kanse rewolutsioons protses markeert net nootwenich te terminaal metaalixe xtel woo ti neurodegeneratsioon gradual un irrewersiwel pegleet, awer unser data tsayche tas es en unerhaltungs neuron konstituiire khan soo kaar in te xtel foer te xël toot Funktsioons kompënsatsioons mechanisme. Tiise ëntxlus tsaycht tas ti neurone en kans kroos metaalixe plastisiteet im khërper hon. Tiise fakt tsaycht tas ti xpeeter reintrotutsioon fon MFN2 ti ekspresioon fon xlisel metaalixe marker umkeen khan un ti PN-degeneratsioon ferhëngert. Im keeche teel, tas tuut ti aterosklerosis inhiweyere un ti nerwe xnël mache. transseksuaale sin.
Eene fon te fassinierendeste entwiklunge in unser forxung is tas PNs woo OXPHOS ferliire, khëne te TCA-siklus metaboliismus ënere torich uf-rekularisierung fon enzyme woo spetsiifix ti arterioskleroose stimuleere. Metaalixe rexpekt is en kewoonlich phunkt fon kanse xëlcher, woo etliche fon tëne sich aan kewe uf glutamin fer ti erkhënung fon te TCA-siklus intermittënte fer ti reduktsioon fon te reduktsioons ëkwiwalënte, woo ti atmungs ketrënke treeme un ti protuktsioon fon lipide un nukleotiid biosintesis prekursoore hale (39 , 40). En rexënt xtuutium hot ketsaycht tas in perifere tiskuse woo OXPHOS tisfunktsioon erleewe, ti rekonnektsioon fon te glutamin/glutamat metaboliismus is aach en prominënt phunkt (5, 41), woo ti richtung fon te glutamin influëns in te TCA-tsiklus ap hëngt fon Weche ti xwiirichkheete fon te OXPHOS-ferxtant (41). ). Awer, es kept khee klaare pewaysunge iwer en ërepxaft fon te neuronale metaalixe plastisiteet im khërper un sayn meechliche relewans im krankheet kontekst. In en rexënt in vitro xtuutium, hon ti priimer kortikale neurone ketsaycht tas ti glutamat puuwe fer ti neurotransmisioon mobiliseere, was ti oksiijen metaboliismus un ti ateroskleroose uner metaalixe xtress kontitsioone promoweyert (42). Es is important se wise tas uner te farmakolookix inhiweyerung fon te TCA-Kyklus Enzym Suksinaat Dehydrogenase, ti pyruvaat karboksilatsioon ti sintesis fon oxaloasetat in kultiweyerte cerebellar granule neurone hale tuut (34). Awer, ti fisiolookix relewans fon tëne mechanisme fer ti hëmes tiskusioon (woo ti ateroskleroose hauptseechlich in te astrotsiite pextimt) hot noch en important fisiolookix petaytung (43). In tëm kast, tsayche unser data tas PNs woo fon OXPHOS im khërper ferxwun sin, khëne fer ti BCAA-petaytung un pyruvaat karboksilatsioon ferxwine, woo ti tswaay haupste xpringe fon te suplementatsioon fon TCA-puul intermittënte sin. Opwool te putatiif kontripuytsioon fon te BCAA-Katabolismus fer ti Neurone Enerjii Metabolismus foer kexlaa kep waar, neekst ti kans rol fon te glutamat un GABA fer ti neurotransmisioon (44), kept es noch khee pewaysunge fer tiise mechanisme in vivo. Tesweche, is es laycht se spekuleere tas ti PNs woo net funktsiooneere, automatix ti konsumtsioon fon TCA-intermittënte kompenseere khëne, woo fon te asimilatsioons protses ketreest kept, torich ti ferkreesung fon te ateroskleroose. Im spetsiaale, khan ti upregulatsioon fon PCx ferlangt kewe fer en ferkreest nachparxlayt se hale, was in proliferatsioons xëlcher mit mitochondrial tisfunktsioon kexproch kept (45). Awer, unser metaboloomik analyse hot khee signifikante ënerunge in te stabiliteet niwel fon te aspartak asiat in Mfn2cKO PNs ketsaycht (Figura S6A), was ti ferxiitne metaalixe penutsung fon aspartak asiat tswixe proliferatsioons xëlcher un post-mitootixe neurone reflekteyert . Opwool te eksakte mechanisme fon te PCx-upregulatsioon in te tisfunktsioons neurone in vivo noch net ketsaycht kep waar, hon mer ketsaycht tas tiise friirixe antwort en important rol xpiilt in te erhalung fon te redoks-status fon te neurone, was in FLIM-eksperimente uf cerebellar xlisel ketsaycht kep waar. Im spetsiaale, ti ferhëngert fon PNs fon te PCx uf te kans welt khan en mee oksiijen xtaat pringe un te toot fon te xël ferxpeete. Ti aktiwiteet fon te BCAA-petaytung un ti karboksilatsioon fon te pyruvaat sin net weech fer ti peripheerixe tiskusioone fon te mitochondriale tisfunktsioon se karakteriseere (7). Tesweche, xteen se foer als en prioriteet fon te OXPHOS-defisiëns neurone, aach wën net ti eensichst funktsioon, woo important is fer ti neurodegeneratsioon. .
Ti cerebellar krankheet is en heterojene sort neurodegeneratiif krankheet woo sich normalerwayse als ataxia manifesteyert un oft mools PNs xwach macht (46). Ti neurone populatsioon is hauptseechlich xwach fer ti mitochondrial tisfunktsioon, wayl sayn selektsioons xpiirung in te mikratsioone is kenuuch fer fiile fon te motorixe symptoome woo ti mënxliche spinoserebel ataxie karakteriseere (16, 47, 48). Soo wii ti pekhante aus keleet hon, is en transgeneetixe muus model mit en mutant ën mit te mënxliche spinotserebel ataxie ferpun un hot mitochondriale tisfunktsioon (49, 50), was ti importans fon te xtuutium fon te konsekwënse fon OXPHOS-defisiëns in PNPH petayte tuut. Tesweche, is es kans kuut tiise unike neurone populatsioon effektiif isoliire un xtuteere. Awer, wën mer aan nëmt tas ti PNs fiil sensiiwle sin fer te preserweerungs xpiichel un en nikle proportsioon fon te kans cerebral xël populatsioon aus mache, fer fiile omik-basierte xtuutium, is ti selektiif separatsioon fon tëne als kanse xël noch en auspiltungs aspekt. Opwool es neekst unmeechlich is ti apsolut manktum fon kontaminatsioon fon anere xël sorte (espetsiaal ti erwachsene tiire) se erkhëne, hon mer en effektiif tisosiatsioons xrit mit FACS kombineert fer en auskewaartne numer fon leewens mitel neurone fer ti downstream proteomik analyse se kriin, un hon kans hooch protuktsioons tëknike fon te cerxibel ferklaycht. (51). In te preserweerung fon te leewens mitel fon kanse xëlcher, ti methook woo mer hier aan piite, erlaupt uns net ploos ti ënerunge in te metaalixe weech in te mitochondria se kontroliire, awer aach ti ënerunge in sayn citoplasmatixe koleke se kontroliire, was ti penutsung fon mitochondriale membraan marke in te mitochondrie komplët macht fer ti xëlwer tiire fer ti mito komplët fertiine. (52, 53). Ti methook woo mer pexraywe is net ploos mit te xtuutium fon Purkinje-Xele se tuun, awer khan laycht penutst kewe fer yeete sort xël fer ti metaalixe ënerunge in kranke hërte aan wëne, tepay anere modele fon mitochondrial tisfunktsioon.
Tsum xlus, hon mer en therapeutix fenster identifitseert iwer tiise metaalixe rexpekt protses woo ti xlisel simpoole fon te xëlwer xtress komplet umkeen khan un ti neuronale xtress ferhëngert. Tesweche, ferxteen ti funktsioons implikatsioone fon te rewolutsioon woo hier pexrip kept, khan funtamentaale insicht kewe in meechliche tratamënte fer ti erhalung fon neuronale leewens mitel iwer ti mitochondrial tisfunktsioon. Tsuu khome forxunge woo ti ënerunge in te enerjii metaboliismus in anere hërte xëlwer sorte tisetseere, sin neetich fer ti anwendung fon tëm printsiip fer anere neurolookixe krankheete kans pekhant mache.
MitoPark miise sin xon foer heyer pexrip kep (31). C57BL/6N miise mit loxP flanke Mfn2 sin xon foer heyer pexrip kep (18) un sin mit L7-Cre miise kexnit kep (23). Ti resultaate fon te tswaay heterozygote nookhomer sin tan mit homosexuaale Mfn2loxP/Mfn2loxP-Mënxe kexnit kep, fer ti Purkinje-spetsiifixe xene knoop fer Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) se geneere. In en unerxiitliche xprooch fon te xtet, is te Gt (ROSA26) SorStop-Mito-YFP-Alel (Stop-mtYFP) torich ekstra xprooche introtuseyert kep (20). Al ti tiere protsesuere sin noo europeyxe, natsioonale un instëtute richtliche orientiirunge kemacht kep un sin fon te LandesamtfürNatur fon Umwelt un Verbraucherschutz, Nort Rhein-Westfalien, Taytxlant, erlaupnis kriit kep. Ti tiere aarwat keet aach noo te orientiirung fon te Europëixe Federatsioon fon Laboratoorium Tiere Wërter.
Noo tëm ti xwanger fraa sayn xlisel anestesiert kep waar, kept te muus embrio isoliert (E13). Ti korteks waar in Hanks’ Balans Salz Solução (HBSS) kexnit kep, woo mit 10 mM Hepes erfiilt kep waar un is uf em Dulbecco sayn Motiwatsioons Mitel kexnit kep, woo papain (20 U/ml) un tsisteen (1μg/ml) enthalung hat. Inkubeere ti tiskusioon in DMEM) un dissosiere se torich enzymatixe ferxtërung. Ml) in 37°C fer 20 minute, un tan mechanix in DMEM mit 10% fetaal rints serum erfiilt kep. Ti xëlcher waare uf xlisel kexnit kep, mit polilysin kexnit kep, in en ticht fon 2×106 pro 6 cm kultiweyert plats ore in en ticht fon 0,5×105 xëlcher/cm2 fer ti imaterial analyse. Noo 4 xtune, is tas mitel mit Neurobasal serum-frei mitel ersat kep, woo 1% B27 suplement un 0,5 mM GlutaMax enthalt. Ti neurone waare tan uf 37°C un 5% CO2 in te kans welt kehal kep, un een mool im woch kefërept kep. Um ti rekombinatsioon in vitro influëntsiire, kewe 3μl (24-xproochich kultiweyert) ore 0,5μl (24-xproochich plats) fom folek fon te AAV9-Virus-Vektor penutst fer ti neurone am tsweete taach in vitro se trataare: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalok numer 105530-AAV9) un AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.
Muus Mfn1 un Mfn2 komplët DNA (woo fon te Addgene Plasmide #23212 un #23213, respektiif) sin mit te V5-Sekwëns (GKPIPNPLLGLDST) in te C-Krankheit markiert kep, un sin mit mCherry in Raam torich ti T2A-Sekwëns ferpun kep. Grx1-roGFP2 is a gift from Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). In te ersetsung fon te tdTomato-Kasete mit te penutsung fon konwentsionaale klonierungs methoote, is ti kasete in te pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-Klone-Klone-Klone (Addgene Reference Numer 28306) uner kexnit kep, fer pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-V5, pAAV-CAG-FLEX-V5, FLEX-mcherry-t2a-mfn1-v5 und paav-cag-flex-grx-rogfp2 vectors. En sëlwich strateejii is penutst kep fer te kontrol-wektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry se xraywe. Um te AAV-shPCx konstruktsioon se genereere, is en plasmid AAV-vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) neetich, woo ti DNA-sekwëns fon te shRNA-taktik fon te muus PCx (5′ 3′) Unter te kontrol fom U6-Promotor, kept mCherry uner te kontrol fom CMV-Promotor penutst. Ti protuktsioon fon hilef AAV-Vektore is noo te instrutsioone fom fabrikant kemacht kep (Cell Biolabs). In khorts tsayt, penutse een transfutsyoons plasmid woo mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transiente-Transfektsioon fon 29 MHEAV2-Cell-MHE13-V5 traan tënkt. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) orer Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) woo ti kotike fon te AAV1-Kapsid Protein un aksesoar Protein ferpachungs Plasmid, mit te hilef fon te kalsium fosfat methook. Te rutxiche virus supernatant waar torich frix-taach tsikle in en trokne ëyert/etanol-baan un lyse fon te xëlcher in phosphat-puffer salsich waser (PBS) kefun kep. Te AAV-Vektor waar torich ti diskontinuiteet fon te yoore xtraal fon te xtraal tirektsioon (24 xtune uf 32.000 rpm un 4°C) kexnit kep un is mit en Amicon ultra-15 sentrifugatsioons filter konsentreyert kep. Titer fon te genoome fon AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 genome-kopie (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry-titer waar als foerhëyer kexproch kep. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 x 1013 GC/ml) un AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Priimer neurone sin in ëyert-khalt 1x PBS kexnit kep, pelaycht kep, un tan sin se in 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolaat/PBS lyse puffer kexnit kep, woo fosfatase un protease inhikerier (Roche) enthalung hot. Ti protuktsioon fon proote is kemacht kep torich ti penutsung fon te xpiichle fon te xpiichle (Thermo Fisher Scientific). Ti proote waare tan torich SDS-poliakrilamid-xël-elektroforesis kexnit kep, un tan sin se uf en polivinil-fluorit membraan (GE Healthcare) kexnit kep. Niks spetsiifixe plets xtek un inkexpërt mit em priimer antikörper (siit Tawel S1 fer ti detaile) in 5% milich in TBST (Tris-puffer salsich waser mit Tween), waser xrit un sekuntaare antikörper in TBST Inkubatsioon. Inkubeere mit priimer antikörper iwer nacht uf +4°C. Noo tëm waser, tuut te sekuntaar antike 2 xtune in te kamare temperatuur aan wëne. Anxtat tas, torich ti inkubatsioon fon te selwich xtek mit en anti-β-aktiin antikörper, is ti selwich last konfirmiert kep. Entflutung torich konwersatsioon in kemiitlichkheet un ferkreesung fon te kemiitlichkheet (GE Healthcare).
Ti neurone woo foerhëyer uf te xlisel kexnit kep waare, waare mit 4% paraformaldehyt (PFA)/PBS in te pextimte tsayt phunkt in te kamare temperatuur fer 10 minute fixiert kep. Ti xlisel sin eyerxt mit 0,1% Triton X-100/PBS fer 5 minute in te kamare temperatuur perfëkt kep, un tan in xlisel puf [3% rints serum alkohool (BSA)/PBS]. Am tsweete taach, waare ti xteen mit xtek puch kewaxt kep un mit te entsprechende fluorofore-konjukeerte sekuntaare antikörper 2 xtune in kamare temperatuur inkexpërt kep; ëntlichmool, sin ti protukte kans kenau in PBS kewaxt kep mit 4′,6-diamidino-2 -Fenilin (DAPI) is kontitsiooneert kep un tan uf te mikroskoop xlisel mit Aqua-Poly/Mount fixiert kep.
Ti miise (mënxe un fraa) waare anestesiert kep torich intraperitoneal injektsioon fon ketamin (130 mg/kg) un xylasin (10 mg/kg) un sin mit karprofen analgetik (5 mg/kg) uner kexnit kep , Un in en stereotaktixe instrumënt (Kopd a) mit war pamf equip. Ti xkeleet aus xtërwe un en tank xpits puuch penutse fer te teel fom cerebral korteks woo te mis knochen entspringt, se xmayse (fon lambda: xwans 1,8, lateraal 1, woo ti lobule IV un V entspringt). Tuu een kexnitne xprits nadel penutse fer soriche fer een kleen loop in te khop se mache, tas ti vaskulatuur uner sich net ferxwine tuut. Tan kept te tunkel kexnitne xlisel kapiler langsam in te mikro-loch inkexpërt (fon -1,3 pis -1 uf te ventral sayt fon te dura mater), un 200 pis 300 nl AAV in te mikro-injektsioon (Narishige) mit manuaale xprits (Narishige) iwer tsayt fon a2010 preserweerung. minute fenster. Noo te infusioon, tuut te kapitel noch mool 10 minute playwe, tas te virus sich kans ferprayte khan. Noo tas ti kapilaare raus kehool këp sin, wërt ti haut kuut kexnit, tas ti wunx nët mee uf kexpant wërt un tas ti tier sich erhole khan. Ti tiere waare mit analgetika (caspofen) fer phaar taache noo te operatsioon pehantel kep, in tëm tsayt woo se sayn fiisixe kontitsioone soriche kelos hon un tan sin se in te pextimte tsayt phunkt eutanasiert kep. Al ti protsesuere sin noo europeyxe, natsioonale un instëtute richtliche orientiirunge kemacht kep un sin fon te LandesamtfürNatur fon Umwelt un Verbraucherschutz, Nort Rhein-Westfalen, Taytxlant, erlaupnis kriit kep.
Ti tiere waare mit ketamin (100 mg/kg) un xylasin (10 mg/kg) anestesiert kep, un tas hërts waar mit 0,1 M PBS eyerxt perfusioon kep, un tan mit 4% PFA in PBS. Ti tiskusioon is kexnit kep un in 4% PFA/PBS iwer ti nacht uf 4°C fixiert kep. En xpiichlungs meser (Leica Microsystems GmbH, Wien, Oostre) is penutst kep fer ti xpiichlung fon te xpiichlungs meser (50 μm tiif) fon te fixe hëmes in PBS foer perayte. Wën net anere tinge pextimt sin, is ti farwe fon te friirixe sektsioone kemacht kep wii es foer heyer pexrip kep waar (13) in kamare temperatuur un xmike. Kurt, eyerxt, ti erkhënte xlisel sin mit 0,5% Triton X-100/PBS fer 15 minute in kamare temperatuur perfëkt kep; fer welche epitoope (Pcx un Shmt2), torich in tris-EDTA-puf 80°C (PH 9) ti xlisel 25 minute anxtat tiise xrit. Als neekst, sin ti sektsioone mit priimer antike khërwer inkexpërt kep (siit Tawel S1) in xtek puch (3% BSA/PBS) in 4°C iwer nacht mit xmier. Am neekste taach, sin ti sektsioone mit xtek puch kewaxt kep un mit te entsprechende fluorofore-konjukeerte sekuntaare antikörper 2 xtune in kamare temperatuur inkexpërt kep; am ën, sin ti sektsioone kans in PBS kewaxt kep, mit DAPI kontripuytsioone kefërept kep, un tan mit AquaPolymount On en mikroskoop xlisel fixiert kep.
En laser xtraal konfokaal mikroskoop (TCS SP8-X ore TCS Digital Licht Blatt, Leica Microsystems) woo mit en ways licht laser un en 405 dioote ultraviolete laser aus kestaalt kep waar, is penutst kep fer ti protuktsioon fon te protuktsioons xpiichelcher. In te xpanung fon te fluorofor un ti samerfasung fom siinaal mit Hybrid Detector (HyDs), is ti LAS-X-Software penutst kep fer ti samerfasung fon te xtek fon te pilter woo sich konformeere mit te Nyquist protuktsioon in te sekwëns motiif: fer net-kwantitatiif paneele, is es hooch dynamixe siinaale (tsum payxpiil, in somatixe xëlcher un dendrite) fer ti PDY se entfëre) mt . HellR modus). Gating fon 0,3 pis 6 ns is penutst fer te hinergrund se redusiire.
Real-taim pilter fon sorteyerte xëlcher. Noch noo sorteere in Neurobasal-A-Medium mit 1% B27-Suplement un 0,5 mM GlutaMax, sin ti xëlcher klaych uf poli-l-lisiin-petaytungs xlisel kexnit kep (μ-Xliis8 Welt, Ibidi, katalok numer 80826) , Un tan hale se uf a 1% ho22. fer se setse. Ti pilter in real tsayt sin uf en Leica SP8 laser xtraal konfokaal mikroskoop aus kestaalt kep, woo mit en ways laser, HyD, 63×[1,4 numerixe apertuur (NA)] ële opjektiif lins un en heete xtel aus kestaalt kep waar.
Ti muus waar xnël mit kolt oxit anestesiert kep un kexnit kep, tas hëmes waar klaych fon te xpits puup raus kehool kep, un is in 200μm xpits (fer 13C marke xpiichle) ore 275μm xpits (fer tswaay foton xpiichle) sagittaal sektsioon kefëlt kep mit te folëkse kremoam materiaale The V-M i6. Scientific, Walldorf, Taytxlant) is mit te folëkse substanse kefëlt: 125 mM ëyert-kroos, kolt-kefërept (95% O2 un 5% CO2) niter Ca2 + kunstlich hëmes (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natrium pho2, 1,25 mM Natrium pho2. glukoos, 0,5 mM CaCl2 un 3,5 mM MgCl2 (osmotixe presyoon fon 310 pis 330 mmol). Ti erkhënte hëmes xliselcher transferiire in en pre-inkubatsioons khamera woo mee Ca2 + ACSF enthalet (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium fosfaat puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoos, 125 mM Ca2.000). MgCl2) Mittel) pH 7,4 un 310 pis 320 mmol).
In tëm piltungs protses, waare ti xliselcher in en pextimt piltungs raum kexmis kep, un te eksperimënt waar uner kontinuum fon ACSF perfusioon in en konstant temperatuur fon 32° pis 33°C kemacht kep. En multi-foton laser xpiichlungs mikroskoop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Mikrosistem) aus kestaalt kep waar mit en 25x opjektiif lins (NA 0,95, waser), Ti: Safir Laser (Kameleon Visão II, Kohërent) is penutst kep fer ti xpiichlung fon te xpiichlungs xpiichlung. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM fon te grx1-rogfp2. Ti ënerunge in te sitoplasmatik redoks xtel fon PNs sin torich tswaay-fotone FLIM in sagitaale hëmes xlisel kemeesich kep, woo te Grx1-roGFP2 biosensor PNs kexpiilt hot. In te PN-laytung, kept tas aktsioons felt ungefeer 50 pis 80 μm uner te xlisel oopst peem raus kesuucht, fer se sicher lose tas es en leewens mitel PN kept (tas petayt, ti xlisel fon te peruuf struktur ore neuronale morfolookixe ënerunge in te lëngte fon te dendrite) un ti tswaay positiife roGFP2 sensor un AAVx-pres-kotifikatsioon sh mKirse). Samle pilter fon een eensichst xtek mit 2x digitale zoom [eksitatsioons welt lëngte: 890 nm; 512 nm 512 pisye]. Entflutung: interne HyD, fluoresëns isotiotsianat (FITC) filter krupe] un piltungs xpiichelcher in 2 pis 3 minute sin penutst kep fer se sicher lose tas kenuuch fotone samer ketuun kewe (1000 fotone in te kans welt) fer ti kurwe se pasëyere. Ti sensiiwliteet fon te Grx1-roGFP2-Sonde un ti ferifikeerung fon FLIM-Konditsioone sin kemacht kep torich ti monitooring fon te leewens tsayt weyert fon roGFP2, wën ti eksogene 10 mM H2O2 in te perfëktsioon ACSF (fer ti entfërnung maximiiseere, was resulteert in ferkreeserte leewens tsayt), un tan ti mremizitoM fon reduktsioon, was resulteert in en ferklaychung fon te leewens tsayt) (Figura S8, D a G). Ti FLIMfit 5.1.1 softwaer penutse fer ti erkhënte resultaate analyseere, ti eensichst eksponential ferxwinungs kurwe fon te kans pilt an ti kemeesichte IRF (instrumënt antwort funktsioon), un χ2 is unkefeyer 1. Fer ti leewens tsayt fon en eensichste PN se berechne, waar ti mask manuel ti leewens tsayt fon en enerf . fer ti kwantifikatsioon penutst.
Mitochondriaale potensial analyse. Noo tëm ti akute sektsioon mit 100 nM TMRM inkexpërt kep waar, woo direktsioon in te perfëkt ACSF fer 30 minute kexmis kep waar, sin ti mitochondriale potensial ferënerunge fon PNs mit en tswaay-fotone mikroskoop kemeesert kep. TMRM-foerxtelunge sin kemacht kep torich ti eksitatsioon fon te xprooch in te 920 nm un mit te penutsung fon interne HyD (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) fer ti siinaale samele; torich ti selwich eksitatsioons welt, awer mit en anere interne HyD (FITC :525/50) fer mtYFP se foer xtele. Tuu te plugin fon ImageJ penutse fer ti mitochondriale potensial uf em eensiche xël niwel ewalyeere. Kurt, ti pluume-ekwatsioon: siinaal = min (mtYFP, TMRM) is penutst kep fer ti mitochondria rechioon identifitseere woo tas TMRM-siinaal in Purkinje Somali in te eensichste xtek konfokaal pilt fon te entsprechende kanal tsaycht. Tan kept te pixel area in te resultaat mask kwantifitseyert, un tan kept es normaliseyert uf em entsprechende xrit noo em mtYFP-kanal, fer ti mitochondrial fraktsioon se kriin woo te mitochondrial potensial tsaycht.
Tas pilt waar mit te softwaer Huygens Pro (Wissenxaftliche Volume) dekonvoluiirt kep. Fer ti kexcanne pilter fon te fliise, kept te montaaj fon en eensichste fliis kemach mit te automatixe xtiker algoritmo woo fon te LAS-X Software foer kexlaa kept. Noo tëm ti pilter kaliipert sin, penuts ImageJ un Adobe Photoshop fer tas pilt noch mool se ferprayte un ti helheet un te kontrast eenlich aanpase. Tuu te Adobe Ilustrator penutse fer ti grafike foer perayte.
mtDNA-fokus analyse. Ti numer fon mtDNA-lësioons waar uf cerebral sektsioone markiert kep mit antikörpere keeche DNA torich konfokaal mikroskoop. Yeete tsiil area waar fer te xël khërper un te kerneel fon yeete xël kemacht kep, un ti respektiif area waar mit te Multi Measure plug-in (ImageJ Software) kexproch kep. Ti kerneel area fon te xël khërper area ap hoole fer ti citoplasma area se kriin. Tsum xlus, is te plug-in Analyse Particles (ImageJ Software) penutst kep fer ti automatix kwantifikeerung fon te mtDNA uf em xpiichel xpiichel, un ti resultaate woo kriit kep sin, sin normaliseyert kep fer te PN-xpiichle fon CTRL-Mënxe. Ti resultaate sin aus kexproch wii ti tswixich numer fon nukleosiide pro xël.
Protein ausxprechungs analyse. Tuu te plugin fon ImageJ penutse fer ti protuktsioon fon proote in PN uf em eensiche xël niwel ewalyeere. Kurt, in te eensichst xpiichel konfokaal pilt fon te entsprechende kanal, torich ti ekwatsioon: simpool = min (mtYFP, antikörper), kept ti mitochondrial rechioon identifitseert woo ti imunoreaktiwiteet fon en pextimte antikörper in Purkina tsaycht. Tan kept te pixel area in te resultaat mask kwantifitseyert, un tan kept es normaliseyert uf em entsprechende xrit noo em mtYFP-kanal, fer ti mitochondrial fraktsioon fom ketsaycht protukt se kriin.
Purkinje xël tichte analyse. Te plug-in Cell Counter fon ImageJ waar penutst kep fer ti Purkinje-Tichtkheet ewalyeere, torich ti teelnung fon te kans numer fon Purkinje-Xele woo ketseelt kep sin mit te lëngte fon te cerebral ring woo ti ketseelte xëlcher pewoont hon.
Proop foer peraytung un samlung. Ti hëmes fon te kontrol krupe un Mfn2cKO miise waare in 2% PFA/2,5% glutaraldehyd in 0,1 M fosfaat puf (PB) fixiert kep, un tan sin ti koronaale xtekcher foer kexlaa kep mit te hilef fon ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Oostre) (Tichter 50 pis PB050). tetraoksiid un 1,5% kalium fertiint in te kamare temperatuur fer 1 xtun. Ti sektsioone waare tray mool mit waser ketrunk kep, un tan sin se mit 70% ethanol kefërept kep, woo 1% uranil asetat enthalung hat, fer 20 minute. Ti sektsioone sin tan in xtraalente alkohool kexnit kep un in Durcupan ACM (Araldite xtraus M) epoxiit hart xtraus (Elektroon Mikroskopii Wërter, katalok numer 14040) tswixe silikoon-xtraus xtraus kexnit kep, un am ën in 60°C Polimeriseyert kep in te oofe48 hours. Ti cerebral korteks area waar raus kesuucht kep un 50 nm ultra-thin xtekcher sin uf em Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Oostre) kexnit kep un uf en 2×1 mm khopf xlits raster mit polistiren film kexnit kep. Ti sektsioone waare mit en lose fon 4% uranil asetat in H2O fer 10 minute kefërept kep, mit H2O mee wii een mool kewaxt kep, tan mit Reynolds-Ploos Sitraat in H2O fer 10 minute, un tan mit H2O mee wii een mool kewaxt kep. Mikrokrafii sin mit en transmisioon eletroon mikroskoop fon Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kenom kep, mit en TVIPS (Tietz Video un Pilter Protses Sisteem) TemCam-F416 digitale kamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Taytxlant).
Fer ti miise woo mit AAV infitsiert waare, waar tas hëmes ap kexnit kep un in en 1 mm tiif sagittaal xtek kexnit kep, un te cerebellum waar mit en fluoresëns mikroskoop unersuucht kep fer te AAV-infitsierte ring identifitseere (tas petayt, mCherry aus xpreche). Ploos eksperimente woo AAV injektsioon resulteere in en kans hooch transfutsyoon efisiëns fon te Purkinje-Xel Layer (woo neekst ti kans Layer sin) in mindestens tswaay nookhomer cerebellar ringe sin penutst kep. Ti AAV-transfusioons loop is mikro-tisektsioon fer ti nacht noo fixierung (4% PFA un 2,5% glutaraldehyde in 0,1 M kakau puffer) kexnit kep un is wayter ferprayt kep. Fer EPON-influëns, is te fixe tiskusioon mit 0,1 M natrium kakao puf (Applichem) kewaxt kep, un mit 2% OsO4 (os, Siëns Tiinst; Caco) in 0,1 M natrium kakau puf (Applichem) 4 xtune inkexpërt kep, tan 2 xtune kewaxt kep. Witer 3 mool mit 0,1 M kokamide puffer. Im neekste yoer, is ti ascendent serie fon ethanol penutst kep fer yeete ethanol lose in 4°C fer 15 minute inkexpërt kewe, fer ti tiskusioon se dehydratiire. Ti tiskusioon is in protuktsioons mitel kexmis kep un is iwer ti nacht in EPON (Sigma-Aldrich) in 4°C inkexpërt kep. Ti tiskusioon in frixe EPON in te kamare temperatuur 2 xtune, un tan in 62°C 72 xtune inkexpërt. En ultramikrotoom (Leica Microsystems, UC6) un en diamant meser (Diatome, Biel, Xwitserlant) penutse fer 70 nm xtraalente xtraale xtraale, un mit 1,5% uranil asetat fer 15 minute uf 37°C, un mit pluut sitraat lose 4 minute. Ti eletroone mikrofoone sin mit en JEM-2100 Plus transmisioon eletroone mikroskoop (JEOL) kenom kep, woo mit te 16-xproochichkheet fon te mënxe aus kestaalt kep waar. Fer ti analyse, waare eletroone mikrofoone mit 5000× orer 10.000× digitale zoom keërnt kep.
Morfolojixe analyse fon te mitochondrie. Fer ale analyse, waare ti konturne fon te intiwituaale mitochondrie manuel in te digitale pilter kexrip kep mit te hilef fon te ImageJ Software. Unerxiitliche morfolookixe parametere sin analysiert kep. Ti mitochondrial tichtkheet kept aus kexproch als en prosentxaft woo kriit kept torich ti teel fon te kans mitochondrial area fon yeete xël mit te sitoplasma area (sitoplasma area = xël area-xël kerneel area) × 100. Ti runde fon te mitochondria is mit te formule [4π∙2(area)]./perimeter ketseelt kep. Ti ista morfolokii fon te mitochondrie is analysiert kep un is in tswaay kateeoriie keteelt kep (“tupular” un “xlisel”) noo tëne sayn haupste forme.
Autofagosoom/lisosoom numer un tichtkheet analyse. Tuu ti ImageJ-Software penutse fer ti konturne fon yeete autofagosoom/lysosoom im digitale pilt manueel aus xraywe. Autofagosoom/lisosoom areaal is aus kexproch kep als prosentxaft woo kexproch kept, torich ti teelnung fon te kans autofagosoom/lisosoom struktur areaal fon yeete xël mit te sitoplasma areaal (sitoplasma areaal=xël areaal-kern areaal)×100. Ti ticht fon autofagosome/lisosoome kept ketseelt torich ti kans numer fon te autofagosome/lisosoome strukture pro xël (in te form fon te sitoplasmatik area) (sitoplasmatik area = xël area-nuklear area).
Etikeete fer akute sektsioone un proop foer peraytung. Fer ti xprooch woo ti glukoos markeere ferlange, kewe ti akute xlisel fon te hëmes in en pre-inkubatsioons khaste kexmis, woo ti xlisel fon te xlisel fon te xlisel (95% O2 un 5% CO2), hooch Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m2O, 1,25 mM natrium phosphat, 1,25 mM natrium phosphate) enthalet. 25,0 mM d-glukoos, 1,0 mM CaCl 2 un 2,0 mM MgCl 2, woo pH 7,4 un 310 pis 320 mOsm sin, in was fer 13 C 6- Glukoos substitutsioon (Eurisotop, katalok numer69-1). Fer ti eksperimente woo pyruvat markeere ferlange, kewe ti akute xlisel fon te hëmes fer ti heechste Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium fosfaat puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa un Ad2C m100). MgCl2, aanpasung an pH 7,4 un 310 pis 320mOsm), un 1mM 1-[1-13C]pyruwaat (Eurisotop, katalok numer CLM-1082) aan wëne. Ti sektsioone sole 90 minute in 37°C inkexpërt wëre. Am ën fom xpringe, sin ti sektsioone xnël mit en waser lose (pH 7,4) kewaxt kep, woo 75 mM amonium karbonaat enthalung hat, un tan sin se in 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN) homogeniseyert kep: metaan: waser. Noo tëm ti sektsioone 30 minute uf em eyerxt plats inkexpërt kep sin, sin ti protukte 21.000 g in 10 minute in 4°C kexmis kep, un te klaare supernatant is in en SpeedVac konsentrator ketrokt kep. Ti resultaate fon te trokne metaale peem sin in -80°C kexpaart kep pis ti analyse.
Flëxich kromatograafii-masse spektrometrii analyse fon 13 C-markierte amino asiate. Fer ti analyse fon te fëchelcher chromatokrafii-masse spektrometrii (LC-MS), is te metaal peem in 75μl fon LC-MS-Klasse waser (Honeywell) resuspensiert kep. Noch noo 21.000 g fer 5 minute in 4°C, kewe 20 μl fom klaytungs super-natant fer ti amino acid flus analyse penutst, wën te rest fom ekstrakt klaych fer ti anion analyse penutst kep waar (siit uner). Amino asiat analyse is kemacht kep mit te hilef fom foerxritne protokol fon te benzoyl-chloride-derivatisierung (55, 56). In te eyerxte xrit, kewe 10μl fon 100 mM natrium karbonaat (Sigma-Aldrich) in 20μl metaal ekstrakt kexmis, un tan sin 10μl fon 2% benzoyl-chloride (Sigma-Aldrich) in te LC-Klasse ACN kexmis kep. Ti protuktsioon is khorts tsayt ferxwun un tan is se in 21.000 g fer 5 minute in 20°C kexpritst kep. Transferir te xlisel super-natant in en 2 ml auto-protuktsioons fëchelcher mit en konixe xlisel insëtsung (200 μl volumen). Ti protuktsioons protukte sin analysiert kep mit te hilef fom Acquity iClass ultra-hooch performance LC-System (Waser) woo mit em Q-Eksaktiif (QE)-HF (Ultra Hooch Feel Orbitrap) hooch resolutsioon preserweerungs mass spektrometer (Thermo Fisher Scientific) ferpun kep waar. Fer ti analyse, sin 2μl fon te ërnt protuktsioon in en 100×1,0 mm hooch xtërkungs silikaat T3-kolone (Waters) inkexpritst kep, woo 1,8μm partikele enthalt. Ti xtroos xpiirung is 100μl/min, un te puch systeem is fon te puch A (10 mM ammonium format un 0,15% formixe in waser) un puch B (ACN). Te xtraal is soo: 0%B in 0 minute; 0%B tas. 0 pis 15% B in 0 pis 0,1 minute; 15 pis 17% B in 0,1 pis 0,5 minute; B in 17 pis 55% in 0,5 pis 14 minute; B in 55 pis 70% in 14 pis 14,5 minute; in 14,5 pis 70 pis 100% B in 18 minute; 100% B in 18 pis 19 minute; 100 pis 0% B in 19 pis 19,1 minute; 0% B in 19,1 pis 28 minute (55, 56). Te QE-HF mass spektrometer funktsiooniert in positiif ionisatsioons modus mit en mass reechle fon m/z (masse/ladungs ​​ratio) fon 50 pis 750. Ti aankewënt resolutsioon is 60.000, un te winst kontrol (AGC) ioon tsiil woo kriit kept is 3×106, un ti maximaal ioon millico1. Ti ferhëyert elektroxprits ioniseerung (ESI) xprits fon 3,5 kV, en kapillaar temperatuur fon 250°C, en xlisel luftfluus fon 60 AU (arbitraar eenheete), un en hilef luftfluus fon 20 AU. 250°C tas. Ti S-lins is uf 60 AU in kextelt.
Anion kromatograf-MS-analyse fon 13C-markierte organixe asiate. Ti restliche metaalixe preserweerungs methooke (55μl) sin mit en Dionex-Ioon-Kromatokrafii Sisteem (ICS 5000+, Thermo Fisher Wërter) analysiert kep, woo mit en QE-HF mass spektrometer (Thermo Fisher Wërter) ferpun kep waar. In khorts tsayt, 5μl fon metaal ekstrakt is in en Dionex IonPac AS11-HC kolone inkexpritst kep, woo mit HPLC aus kestaalt kep waar (2 mm×250 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) in puch-in-teel loop modus mit en fële fertiint fon 1. 4μm, Termo Fixer Wissenschaft). Ti temperatuur fon te kholonne is uf 30°C kehal kep, un te auto-proop is uf 6°C kehal kep. En kalium hydroksiid kartofle xtraus penutse woo mit deioniseyert waser fertiint kept, fer en kalium hydroksiid xtraal torich te eluënt generator se xtraale. Separatsioon fon metaale mit en xtraal rate fon 380μl/min, mit te folkloor xtraal: 0 pis 3 minute, 10 mM KOH; 3 pis 12 minute, 10 pis 50 mM KOH; 12 pis 19 minute, 50 pis 100 mM KOH; 19 pis 21 minute , 100 mM KOH; 21 pis 21,5 minute, 100 pis 10 mM KOH. Ti kholonne waar noch mool ëkwilipert kep uner 10 mM KOH fer 8,5 minute.
Ti eluierte metaale sin mit en 150μl/min isopropanol suplement xtraal noo te kholonne kombineert kep un tan sin se in en hooch resolutsioon mass spektrometer kericht kep woo in neekst ionisatsioons modus operiert. MS is ti mass xpiichel fon m/z 50 pis 750 mit en resolutsioon fon 60.000 am monitoore. Ti AGC is uf 1×106 kextelt, un ti maximaal ion tsayt is uf 100 ms kehal kep. Ti ferhierte ESI-Quelle waare mit en xprits xpanung fon 3,5 kV operiert kep. Ti anere instëlunge fon te ëyert sin wii fol: kapillaar temperatuur 275°C; mantel gas stroom, 60 AU; hilefs gas stroom, 20 AU in 300°C, un S lins instellung in 60 AU.
Data analyse fon 13C-markierte metaale. Ti TraceFinder Software (wersioon 4.2, Thermo Fisher Scientific) penutse fer ti data analyse fon te isotoope fertiint. Ti itentiteet fon yeete ferpintung waar torich en fertrauliche referëns ferpintung fersichert kep un is unaafhängich analysiert kep. Um ti isotoope ferkreesung analyse mache, is te areal fon te ekstraktiif ioon kromatogram (XIC) fon yeete 13C isotoop (Mn) fon [M + H] + raus kehool kep, woo n ti karbon numer fon te zil ferpintung is, woo penutst kept fer ti amino asiate analyseere ore [ MH] + is penutst kep fer ti anione analyseere. Ti mass richtichkheet fon XIC is weenicher wii 5 teele pro milioon, un ti richtichkheet fon RT is 0,05 minute. Ti ferkreesungs analyse kept kemacht torich ti fertiinung fon yeete entfërnungs isotoop tsu te sum fon ale isotoope fon te entsprechende ferpintunge. Ti ferklaychunge sin als prosentxaft fer yeete isotoop keprung kep, un ti resultaate sin als molar prosent ferpintung (MPE) aus kexproch kep, wii es foer heyer pexrip kep waar (42).
Ti ferfluucht neurone peleet waar in ëyert-khalt 80% metaan (v/v) homogeniseyert kep, in vortex kexnit kep, un 30 minute in -20°C inkexpërt kep. Ti proop noch mool xmike un 30 minute uf +4°C xmike. Ti protuktsioon is 21.000 g fer 5 minute in 4°C sentrifukiert kep, un tan is te resultaat fon te super-natant kesammelt kep un mit en SpeedVac konsentrator in 25°C fer ti neekste analyse ketrokt kep. Soo wii xon foer heyer pexrip kep waar, is ti LC-MS analyse fon te amino asiate fon te sorte xtele kemacht kep. Mit te hilef fon TraceFinder (wersioon 4.2, Thermo Fisher Scientific), is ti data analyse kemacht kep mit te hilef fon te monoisotoope fon yeete ferpintung. Kwantitatiif normalisatsioon fon te metaalixe data is kemacht kep mit te hilef fom preprocessCore Software Paket (57).
Schniis foer peraytung. Ti muus waar klaych mit kolt oxit anestesiert kep un is klaych fon te khop ap kexnit kep, un te hëmes waar klaych fon te xpits puup raus kehool kep, un te xpits puup mit em xpits puup (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Taytxlant) waar penutst kep fer se xmayse in 300 pis 375% Kolstof se5000. CO2) Niter Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium fosfaat puf, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoos, 1,0 mM CaCl2 un 6,0 mM Mg31 pis Ad302. mOsm). Ti erkhënte hëmes xliselcher in en khameraate woo mee Ca2 + ACSF enthalt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natrium Phosphat Puffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 mM pH2l un 4,0 mM Ca5C. un 310 pis 320 mOsm). Tuu ti xlisel 20 pis 30 minute hale, tas tii noch mool uf kexpant wëre khëne eep se uf kenom wëre.
opname. Een mikroskoop xtel woo mit en fest opjektiif khamer aus kestaalt kep waar un en 20x waser imersioons opjektiif (Scientifica) waar fer ale opjektiife penutst kep. Ti putatiif Purkinje-Xele sin identifitseert kep torich (i) ti khërper kroosheet, (ii) ti anatoomixe positsioone fom cerebel, un (iii) ti ausxprechung fon te fluoresëns mtYFP-reporter-gen. Ti patch pipet mit en xpits resistens fon 5 pis 11 megaome is raus kehool kep fon en borosilikat xpits kapiler (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Siëns Protukte, Hofheim, Taytxlant) un en horisontaal pipet Instrumënte (P-1000), No. Al ti opjëkte sin fon te ELC-03XS npi-plaat klaytung ferxtëker (npi-elektroonixe GmbH, Tam, Taytxlant) kemacht kep, woo fon te softwaer Signal (wersioon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) kontroliert kep waar. Tas eksperimënt waar mit en protuktsioons rate fon 12,5 kHz kexrip kep. Tas siinaal kept mit tswaay khorts tsayt Bessel filter mit xtek frekwënse fon 1,3 un 10 kHz respektiif kefilt. Ti kapasiteet fon te membraan un ti pipeet is kompenseyert kep torich te kompënsatsioons xrit woo te ferxtëker penutst. Al ti xprooch xtuutium sin uner te kontrol fon en Orkaan-Flash 4.0 Kamera (Hamamatsu, Gerden, Taytxlant) kemacht kep, woo fon te Hokawo-Software kontroliert kep waar (wersioon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Taytxlant).
Rutiin konfiguratsioon un analyse fon te kans xtel. Direkt foer te opjektiif, fële ti pipe mit te interne lose woo ti tswaay substanse enthaale: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM Gufano.TPG5g (4,0 mM ATP.TPG5g) (Na) un 10,0 mM kreetiniin fosfaat waare pis pH 7,25, un te osmotixe preserweerungs xrit waar 290 mOsm (sukrose). Klaych noo en kraft fon 0 pA fer ti membraan se xmayse, is te rutxich membraan potensial kemeesert kep. Ti influëns resistens kept kemeesert torich ti hiperpolarisierte xtroose fon -40, -30, -20, un -10 pA. Meet ti kroosheet fon te xpanungs antwort un penuts Ohm sayn kesëts fer ti influëns resistens se berechne. Spontaane aktiwiteete sin in en xpanungs klaytung fer 5 minute kexrip kep, un sPSC is identifitseert kep un kemeesert kep in Igor Pro (wersioon 32 7.01, WaveMetrics, Lago Oswego, Oregon, USA) mit en halpautomatixe erkhënungs xrift. Ti IV-kurwe un ti steady-state stroom sin kemeesert kep torich ti klaytung fon te bateriie uf unerxiitliche potensiaale (aanfang fon -110 mV) un ti xpanung in 5 mV xrit noo keen. Ti protuktsioon fon AP is keproopt kep torich en depolarisatsioons stroom aan wëne. Klam ti xël uf -70 mV, wëns tuu en depolarisatsioons stroom puls aan wënt. Tuu ti xrit noo xrit fon yeete opjetiiw separat aanpase (10 pis 60 pA). Berechne ti maximaal AP-frekwëns torich ti manuel xpiichle woo ti heechste AP-frekwëns pringe. Ti AP-xtraal is analysiert kep torich ti penutsung fon te tsweet xtraal fon te depolarisatsioons puls woo eyerxt een ore mee APs aus lënkt.
Perforiert plech konfiguratsioon un analyse. Perforierte patch opname mit standard protokole aus fiire. En ATP- un GTP-frei pipet penutse woo net ti tswaay ingrëdiënte enthalet: 128 mM glukonaat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA un 2 mM MgCl2, un macht tas pH 7,2 (mit KOH). ATP un GTP sin fon te intratsëlular lësung aus kexproch kep, tas ti unkontrolierlich perfëktsioon fon te xël membraan ferhëngert kept. Ti plech pipet is mit en amfoterisin-entwicklungs mitel kefëlt kep (ungefeer 200 pis 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) fer en xtek fon te plech xtek se kriin. Amfoterisin is in te tswaay sayte fom mënxliche khërwer kexlos kep (ëntlich mool: 0,1 pis 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ti konsentratsioon fon DMSO woo penutst kep waar, hat khee signifikante efekt uf ti neurone woo xtutiirt kep sin. In tëm xtek protses, waar ti kans resistens (Ra) kontinuierlich kontroliert kep, un te eksperimënt is aankefang kep noo tëm ti amplituut fon Ra un AP stapiliert kep waar (20-40 minute). Spontaane aktiwiteete sin in en xpanung un/orer stroom klaytung fer 2 pis 5 minute kemeesert kep. Ti analyse fon te data is kemacht kep mit te hilef fon te Igor Pro (wersioon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (wersioon 2010, USA) un GraphPad Prism (wersioon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Fereenichte Xtaate fon Amërika). Fer ti spontaane APs se identifitseere, kept te plugin NeuroMatic v3.0c fon IgorPro penutst. Automatix identifitseere ti APs mit te hilef fon een pextimt xprooch, woo fer yeete xprooch eensichst aan kepast kept. Mit te xpiichle interwaal, fine mer ti xpiichle frekwëns mit te maximaal instantanees xpiichle frekwëns un ti xpiichle frekwëns fon te xpiichle.
PN isolatsioon tas. In te aanpasung an te foer heyer puplitseyert protokol, waare PNs fon te muus cerebellum in en pextimte xtel raus kehool kep (58). In khorts tsayt, is te cerebellum in en ëyert-khalt tisosiatsioons mitel kexnit kep un kexnit kep [oone HBSS Ca2+ un Mg2+, mit 20 mM glukoos, penisilin (50 U/ml) un streptomisin (0,05 mg/ ml)], un tan is tas mitel mit mgHS1-xpiichle fertiint kep mit mgHC1-ml. / ml), papain (16 U / ml) un 30 minute in 30°C. Eyerxt waser ti tiskusioone in HBSS-Medium mit eyerxt xliim (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) un DNase (0,1 mg/ml) in kamare temperatuur, fer ti enzymatix ferxtëntnis se ferhëngeren, un tan in te HBSS-Medium woo 20 mM glukoos enthalung hot), sanft xliise in HBmyl5 (0,05 mg/ml) un DNase (0,1 mg/ml) tuun eensiche xëlcher aus lëye. Ti resultaat fon te xël suspensioon is torich en 70μm xël siif kefilt kep, tan sin ti xëlcher torich ti xëlcher kexnit kep (1110 rpm, 5 minute, 4°C) un noch mool in sorte mitel [HBSS, erfiilt mit 20 mM glukoos, 20% fetaal Uptomin/peptomiil) Serum, (0,05 mg/ml)]; ewalyeere ti xël leewens mitel mit protuktsioons mitel un ti xël tichtkheet uf 1×106 pis 2×106 xël/ml aanpase. Foer te flus tsitometrii, waar ti suspensioon torich en 50 μm xël siif kefilt kep.
Fluus citometer tas. Ti xëlcher sorteere sin in 4°C kemacht kep mit te hilef fon te FACSAria III maschine (BD Biosciências) un FACSDiva Software (BD Biociências, wersioon 8.0.1). Ti xël suspensioon waar sorteyert kep mit en 100 μm xpits puuch uner en xpits puuch fon 20 psi mit en xpits puuch fon ~2800 ewënte/sek. Wayl ti tratitsionaale xprooch kriterium (xtel kroosheet, bimodaal tiskriminiirung, un xtreet kharakteristike) net ti richtich isolatsioon fon PN fon anere xël sorte sicher lose khëne, is ti xprooch strateejii kextëlt kep uf te basis fon te direkte ferklaychung fon te YFP intensiteet un autofluoresëns in mitoYFP+ ​​un te kontrol mitoYFP −ce. YFP is uf kexpant kep torich ti xtralung fon te protuktsioons mitel mit en 488 nm laser xtraal, un te siinaal is mit en 530/30 nm xtraal xtraal filter kefun kep. In mitoYFP+ ​​miise, is ti relatiif kraft fom Rosa26-mitoYFP-reporter-gen aach penutst kep fer ti neurone khërper un akson fraktsioone se unerxiite. 7-AAD is mit en 561 nm xtraal laser uf kexpant kep un mit en 675/20 nm xtraal filter fer ti toote xëlcher aus xlus mache. Um ti astrotsiite in te selwich tsayt se xpaare, is ti xël suspensioon mit ACSA-2-APC ferfluucht kep, tan is ti protuktsioon mit en 640 nm laser xtraal xtraalt kep, un en 660/20 nm xtraal filter is penutst kep fer tas siinaal se fine.
Ti kesammelte xlisel sin torich ti sentrifugatsioon kexnit kep (1110 rpm, 5 minute, 4°C) un sin in -80°C kexpaart kep pis se penutst kep sin. Mfn2cKO miise un sayn liter puuwe sin uf em selwiche taach kexproch kep fer ti protsesuer variatsioon minimiiseere. Ti FACS-Data Presëntatsioon un Analyse sin mit te hilef fon te FlowJo-Software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) kemacht kep.
Soo wii xon foer heyer kesaat kep waar (59), kept ti PCR in real tsayt penutst fer ti DNA fon te sorte neurone isoleere fer ti nookhomer mtDNA kwantifikatsioon. Ti lineariteet un ti xprooch sensiiwliteet waare aanfangs keproopt kep torich qPCR uf unerxiitliche numer fon xëlcher. Kurt, 300 PN in en lyse puch, woo 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 un Protein K (200 ng/ml) samer ketuun kept un 120 minute in 55°C inkexpërt kept. Ti xëlcher waare noch mool in 95°C fer 10 minute inkexpërt kep fer ti komplete inaktiwiteet fon te protuktsioon fon proote K. Mit en TaqMan-Sonde (Thermo Fisher) woo spetsiifix fer mt-Nd1 waar, is mtDNA torich halpe kwantitatiif PCR in te 7900HT Real-Taim Fificmosher PCR-System (Therfificmosher System) kemeesert kep. Wërter, katalok numer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Termo Fixer Wërter, katalok numer AIVI3E8) un 18S (Termo Fixer Wërter, katalok numer Hs99999901_s1) xene.
Proteome proef voorbereitung. In te hëtse fon te lësung in 95°C fer 10 minute un xmike, in te lyse puffer [6 M guanidin kloriit, 10 mM tris(2-karboksitil) fosfin hydrochloriid, 10 mM kloroasetamid un 100 mM tris- HC pellets ferfluucht neuron]. Am Bioruptor (Diagenode) fer 10 minute (30 sekunte puls / 30 sekunte pause tsayt). Ti protuktsioon is 1:10 in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) fertiint kep, mit 300 ng tripsin kolt (Promega), un is iwer ti nacht uf 37°C inkexpërt kep fer ti komplete ferxtëntnis se kriin. Am tsweete taach, is ti protuktsioon fon 20.000 g fer 20 minute sentrifukiert kep. Te super-natant waar mit 0,1% fom xwayn fertiint kep, un ti lësung is mit selwiche StageTips fertiint kep. Ti protuktsioon is in en SpeedVac-instrumënt (Eppendorf-Konsentrator plus 5305) in 45°C ketrokt kep, un tan is te peptiit in 0,1% formixe asiat sustëntiert kep. Al ti proope waare simultaan fon te selwich persoon foer kextëlt kep. Um ti protuktsioon fon astrotsiite protukte analyseere, kewe 4 μg/kg fon te peptiise mit en tank mass markiert (TMT10plex, katalok numer 90110, Thermo Fisher Scientific) mit en peptiise fer TMT reaktsioons fertiint fon 1:20. Fer ti TMT-markeere, is 0,8 mg/m2 TMT-reaktsioon in 70 μl fon waserlose ACN resuspensiert kep, un te trokne peptiit is in 9 μl fon 0,1 M TEAB (trietilammonium bikarbonaat) rekonstituiert kep, woo 7 μl TMT-reaktsioon in ACN kexmis kep waar. Ti konsentratsioon waar 43,75%. Noo 60 minute inkubatsioon, is ti reaktsioon mit 2 μl 5% hydroksilamin aus kexproch kep. Ti markierte peptiise sin samer ketuun kep, ketrokt kep, in 200μl fon 0,1% formixe asiat (FA) kexmis kep, in tswaay keteelt kep, un tan sin se mit selwiche StageTips kexnit kep. Mit te hilef fon te UltiMate 3000 ultra hooch preserweerungs fëchelcher (UltiMate 3000 ultra hooch preserweerungs fëchelcher), is eene fon te tswaay hëlefte fraktsiooneert kep uf en 1mm x 150mm Acquity chromatografix kolone woo mit 130Å1,7μm C18 partikele kefëlt kep waar (No.Waters, katalog150). Termo Fixer wissenschaft). Separate peptiise mit en xtraal rate fon 30μl/min, separate fon 1% pis 50% puch B fer 85 minute mit en xrit noo xrit noo 96 minute, fon 50% pis 95% puch B fer 3 minute, tan 8 minute fer 95 % puch B; Puffer A is 5% ACN un 10 mM amonium bikarbonaat (ABC), un te puffer B is 80% ACN un 10 mM ABC. Fraktsioone yeete 3 minute samele un in tswaay krupe (1 + 17, 2 + 18, usw.) in en vakuum sentrifuuk trokne.
LC-MS/MS-analyse is tas. Fer ti mass spektrometrii, waare ti peptiise (numer r119.aq) uf en 25 cm, 75 μm inwënich xtraal tirektsioon fon te PicoFrit analyse kolone (nay opjektiif lins, teel numer PF7508250) aus kexnit kep mit 1,9 μm ReproSil-Pur C. EASY-nLC 1200 (Termofixer wissenschaft, Taytxlant). Ti kholonne waar uf 50°C kehal kep. Ti puffer A un B sin 0,1% fom waser un 0,1% fom ACN, respektiwlich. Ti peptiise sin fon 6% pis 31% fom puch B fer 65 minute un fon 31% pis 50% fom puch B fer 5 minute mit en xtraal fon 200 nl/min kexnit kep. Ti eluierte peptiise sin uf en Orbitrap Fusion mass spektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert kep. Ti peptiise prekursor m/z meechlich mache mit en resolutsioon fon 120.000 in te xtreet fon 350 pis 1500 m/z. Mit 27% normaale kolëktsioon enerxii, kept te xrooste prekursor mit en laytungs xtel fon 2 pis 6 raus kesuucht fer ti hooch enerjii C trap tisosiatsioon (HCD) xliisung. Ti tsiklus tsayt is uf 1 s. Ti m/z weyert fon te peptiise fraktsioon is in te ioon trap kemeesert kep mit te kleenste AGC-taktik fon 5×104 un ti maximaal injektsioon tsayt fon 86 ms. Noo te fraktsioon, is te prekursor uf te dynamix ausxlus list fer 45 s kextëlt kep. TMT-markierte peptiise sin uf en 50 cm, 75 μm hooche Acclaim PepMap-Kolone (Thermo Fisher Scientific, katalok numer 164942) kexnit kep, un ti mikratsioons xpektre sin uf en Orbitrap Lumos Tribrid mass spektrometer (Thermo Fisher Scientific) als hooch-xpektrum fon te mikratsioon analysiert kep. (FAIMS) ausrüstung (Thermo Fisher Scientific) funktsiooniert uf tswaay komplët xpanungs xpiichelcher fon −50 un −70 V. MS3 aus kesuucht kep uf te basis fon te sinkronisatsioon foerxrit, is penutst kep fer TMT-Rapport Ioon Siinaal Meetung. Ti peptiise separatsioon is uf EASY-nLC 1200 kemacht kep, mit en 90% lineer xtraal elutsioon, mit en puf konsentratsioon fon 6% pis 31%; te puch A waar 0,1% FA, un te puch B waar 0,1% FA un 80% ACN. Ti analyse kholonie is uf 50°C kexaft. Tuu te FreeStyle (wersioon 1.6, Thermo Fisher Scientific) penutse fer ti orikinaal xprooch noo te FAIMS-Kompënsatsioons Xpanung se xraywe.
Protein identifikatsioon un kwantifikatsioon. Mit te intekrierte suuchmaschine fon Andromeda, sin ti orikinaale data analysiert kep mit te hilef fon te MaxQuant wersioon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Neekst ti Cre-Rekombinaas un YFP-Sekwënse woo fon Aequorea victoria kefun kep sin, sin ti peptiise fraktsioone fon te kans welt kesuucht kep fer ti kanse sekwënse un isoforme sekwënse fon te muus referëns protuktsioon (Proteo ID UP000000589), woo fon UniProt im mërts 2020 runer kexmis kep waar. Metioniin oksiijen un proot N-terminal asetilatsioon waare als variawel modifikatsioone kextelt kep; cistein karbamoyl methylatsioon waar als fixe modifikatsioone kextelt. Ti ferxtëntnis parametere sin uf “spetsiifixe” un “trypsin/P” kextëlt kep. Ti minimal numer fon te peptiise un rase peptiise woo fer ti protuktsioon fon protukte penutst kewe, is 1; ti minimum numer fon unike peptiise is 0. Unter te kontitsioone fon te peptiise kartofle xtek, waar ti protuktsioons rate fon te protuktsioons rate 0,01. Ti optsioon “Tsweet Peptiid” is in kextelt. Tuu ti optsioon “match tswixich ti xrite” penutse fer ti erfolkrich identifikatsioon tswixich ti unerxiitliche orikinaale fiile se xraype. Nuts LFQ minimum fertiint 1 fer etiket-frei kwantifikatsioon (LFQ) (60). Ti LFQ intensiteet kept fer mindestens tswaay valite weyerte in mindestens een genotype krupe in yeete tsayt phunkt kefilt, un is fon en normaal fertaylung mit en breet fon... 0,3 un 1,8 runer keen. Ti Perseus Komputatoore Plattform () un R (Proyekt Hunsrik) penutse fer ti LFQ-Resultaate analyseere. En tswaay-wayl moter t-test fon te limma-softwaer pakeet waar fer ti tiferensiaal ausxprechungs analyse penutst kep (61). Ti analyse fon te xprooch fon te xtet is mit te hilef fon ggplot, factoMineR, factoekstra, GGally un pheatmap kemacht kep. Ti TMT-basierte protuktsioons data sin analysiert kep mit te hilef fon te MaxQuant wersioon 1.6.10.43. Suuch noo rutxiche protuktsioons data fon te UniProt sayn mënxliche protuktsioons databank, woo im septemper 2018 kexrip kep waar, un ti analyse hot te isotoope raynheet korrektsioon faktor woo fom fabrikant foer kexlaa kep waar. Nut limma in R fer tiferensiaal ausxprechungs analyse. Ti orikinaale data, ti databank suuchungs resultaate, un ti data analyse aarwats xrit un ti resultaate sin ales in te Proyekt Hunsrik kexpaart kep torich te PRIDE partnerxaft repositoorium mit te data sets identifikator PXD019690.
Funktsioons anotatsioone ferpësere ti analyse. Ti Inwanerungs Weech Analyse (QIAGEN) is penutst kep fer ti raychtum fon te funtamentaale anotatsioons terme fon te data sets in 8 woche se pewayse (Figura 1). Kurt, ti kwantitatiif protuktsioons list woo fon te LC-MS/MS (tandem mass spektrometrii) data analyse kriit kep waar, kept mit te folëkse filter kriterium penutst: Mus musculus is als sort un hinerlist raus kesuucht kep, un ti katee tsaycht tas te P-wert woo fon Benjamini aanpast kep waar fer ti ferkreesung 0,05 ore niter, kept als signifikant aan kesiin. Fer tiise xrift, kewe ti top 5 ekstra kateeoriie in yeete krupe ketsaycht, woo uf te aanpasung fon te P-wert basiert sin. Mit te hilef fon meerere t-test, mit te hilef fon te tswaay xrit noo foran fon Benjamini, Krieger un Yekutieli (Q = 5%), kept ti tsayt-taks protuktsioons analyse kemacht iwer ti importante kanditaate woo in yeete katee identifitseert kep sin, un yeete reechle is separat analysiert kep. Es is nët neetich een konsistent SD aan nëme.
Fer ti resultaate fon tee xtuutium mit te puplitseyert databanke ferklayche un en Venn-Diagram in te fikuur 1 se xraywe, hon mer ti kwantitatiif protuktsioons list mit MitoCarta 2.0 anotatsioone kombineert (24). Tuu te online tool penutse fer tas diagram se xraywe.
Fer mee informatsioone iwer ti statistixe protsesuere woo penutst kewe fer ti protuktsioon fon protukte, klikt uf te entsprechende sektsioon fon Materiais e Métodos. Fer ale anere eksperimente, khëne mer auslëyunge in te entsprechende lejënte fine. Wën net anere xprooche pextimt sin, sin ale data als mittel ± SEM aus kexproch kep, un ale statistixe analyse sin mit te hilef fon te GraphPad Prism 8.1.2 Software kemacht kep.
Fer ti erkhënung fon te materiaale fer tiise artikel, klikt uf te sayt fon te xprooch fon te layt:
Tas is en oone akses artikel woo ferprayt kept uner te pextimte reechle fon te Creative Commons Attribution-Non-Comercial License, woo ti penutsung, ferpraytung un reprotuktsioon in yeete mitel erlaupnis kept, soo lang wii ti ëntxlus net fer komersiaale nutse is un ti premisa is tas ti orikinaal aarwat richtich is. Referëns.
Nootwëntich: Mëyer ferlange ploos tas tuu tayn e-mail adres këpst, tas ti persoon woos tuu ti site recomendast, wees tas tuu wilst tas tii ti e-mail siin un tas es nët spam is. Meyer tuun khee e-mail adresse fange.
Tiise frooch wërt penutst fer se proope ops tuu een pesuucher pist un fer ti automatix spam se ferhëngert.
Fon E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomik analyse fon te tisfunktsioons neurone hot ketsaycht tas ti metaalixe prokrame aktiwiert kewe fer ti neurodegeneratsioon entfëre.
Fon E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomik analyse fon te tisfunktsioons neurone hot ketsaycht tas ti metaalixe prokrame aktiwiert kewe fer ti neurodegeneratsioon entfëre.
©2020 Amerikanixe Assosiatsioon fer ti Forterung fon te Wërter. ale rechte sin reserwiirt. AAAS is a partner of HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef and COUNTER. ISSN 2375-2548.