Presënt†Aktuaal adres: OX11 0DE, UK, Diamante Kepau, Harwell Siëns un Inwanerungs Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamante Licht Quelle Co.
Te reaktsioons sentrum licht-ernte komplëks 1 (RC-LH1) is te kerneel fotosintesis komponënt fon lila fototrofe bakterie. Meyer hon tswaay kriyo-elektroonixe mikroskopixe strukture fom RC-LH1 komplëks fon te Rhodopseudomonas Palustris introtuseyert. Ti 2,65-Å resolutsioons struktur fom RC-LH114-W komplëks hot 14 unerxiitliche LH1 loope um RC rom, woo fon te protuktsioon fon protukte W uner keproch kept, wën te komplëks oone protuktsioons-W komplet RC kompozitsioon umkeprung kept fon RC. Ferxlos 16 unter eenheet LH1 loop. Ti ferklaychung fon tëne strukture kept insicht in ti tinamike fon te kinone in te RC-LH1 komplëks, tepay ti foer heyer net pextimte konformatsioons ënerunge wën ti kinone uf te RC QB-Site xteen, soo wii ti positsioon fon te hilefs Kinone-Site, woo helfe se Pass to RC. Ti unike struktur fom W-protukt ferhëngert ti ferxlus fon te LH1-loop, un soo, macht en kanal fer ti ferxtëntnis fon te kinoon/kinolon austausch.
Ti enerxii woo ti fotosintesis pringt, khan neekst tas kanse leewe uf te Eyert hale, un tii hot kroose potensial fer ti sun sayn bioteknolokii. Wën ti weltwayt fotosintesis promoweyert kept, tuun ti lila fototrofe bakterie aach ferxiitne enerjii motife un metaalixe kapasiteete tsayche. Tii khëne ti fotosintesis fermixe un als heterotrofe bakterie in te tunkelheet wakse, khëne xtik fii un kolt xif fixe, waserstof protutseere un aromatixe ferpintunge ferxwine (1-3). Fer enerxii fer tiise protses se kriin, mus tas licht xnël un efisiënt in kemixe enerxii um kewanert wëre. Tiise protses fangt aan wën te licht-trayp antene komplëks tas licht uf nëmt un ti trayp enerxii in te reaktsioons sentrum (RC) iwertraypt, un soo, fangt ti layt separatsioon aan (4 – 7). Ti basis eenheet fon te fotosintesis in lila fototrofe bakterie is fon te 2a RC, umkeprung fon te licht-erkhënungs komplëks 1 (LH1), woo te RC-LH1 kern komplëks formt. LH1 is fon en ray fon krupe αβ-heterodimere kemacht kep, woo yeete eene tswaay bakterie klorofil (BChl) en moleküle un een ore tswaay karotenoide ferpint (8-12). Ti eensichste LH1 antene sin fon 16 ore 17 αβ heterodimere woo RC umfase (9-13) in en ferxlosne loop, awer in anere kerneel komplëxe, transfusioone fon te peptiise uner xtele ti kontinuiteet fon te umkefeyer LH1 , Soo, ti kinol/kinol komplëks tifusioon tswixe bRC1, 13-15). Ti lila fototrof plans Rhodopseudomonas (Rps.) is en modelo fon organismus woo ti enerxii un ti eletroone iwertragung ferxteen khan woo ti fotosintesis unerxtitst. Ti eyerxt kristal struktur fon Rps. Te modelo fon te palustris RC-LH1 komplëks is RC, umkeprung fon 15 heterooksiiter LH1 loope, woo fon en unkeweenlich protukt woo “Proot W” heest, uner keproch kept (14). Protein-W is noo heyer identifitseert kep als RPA4402, was en unkeweenlich 10,5kDa protukt mit tray foerxtelunge fon transmembraan helixe (TMH) is (16). Meyer xtele foer tas te rpa4402-Krankheits-Krankheits Protukt W in pufW ënere sol, tas ti nomenklatuur woo penutst kept fer ti RC-L, M (pufL, pufM) un LH1α, β (pufA, pufB) unerxtitsungs eenheete. Interessant is tas te proot-W ploos in unkefeer 10% fon te RC-LH1 present is, was Rps orkaniseyert. palustris macht tswaay unerxiitliche RC-LH1 komplëxe. Hier, xpreche mer iwer ti hooch resolutsioon fon te krio-EM (krio-EM) strukture fon tswaay kerneel komplëxe, eene mit protukt W un 14 αβ heterotimere, te anere oone protukt W un en ferxlosne 16 Heterodimere LH1 loop. Unser struktur representeyert en xrit noo foran in te ferxtëntnis fon te RC-LH1 komplëks fon Rps. palustris, wayl meyer ti homogene populatsioon fon yeete variant analysiert hon un hon kenuuch resolutsioon fer yeete peptiit un ti ferpintunge fon te picher un ti ferwante lipide un kinone klaych aan kewe. Ti ferklaychung fon tëne strukture tsaycht tas ti tray TMH protukte-W woo pis hayt noch net in en anere RC-LH1 komplëks kefun kep sin, en kinoon kanal xpiire fer te kinoon/kinoon austausch se ferxpeete. En kans numer fon konserweyert lipide un kinone ferpintungs sites sin identifitseert kep, un meyer hon en nay konformatsioons ënerung noo te kombinatsioon fon kinone un RC ketsaycht, woo fer te fotosisteem II (PSII) RC fon oksiijen fototrofe organisme kenuuch sin khan. Unser entwiklung kept naye insicht in ti kinetik fon te kinoone/kinoone ferpintung un austausch im RC-LH1 kern komplëks fon lila fototrofe bakterie.
Um en detailliert xtuutium fon te tswaay komplëxe woo in Rps. palustris, tuun mer yeete RC-LH1 torich ti biokimixe methoote isoliire. Te protukt W-defitsiënt komplëks (woo hier ΔpufW kenënt kept) is fon te xtam woo te pufW-gen (16) ferloer hot, un ploos een RC-LH1 komplëks khan protutseert kewe. Tas proot W-komplëks is fon een xtam kemacht kep. Tas proot W fon tee xtam is mit en 10x His-taach in sayn C-terminus modifitsiert kep, soo tas te proot W-petaytungs komplëks effektiif mit te meyerxte ferkheerte proote W kombineert kewe khan, torich ti imopilierung fon metaale. Tas komplëks is effektiif separat (16) Affiniteet Chromatograafii (IMAC).
Soo wii in te fikuur 1 ketsaycht kept, hon ti tswaay komplëxe en tray unerxiitliche RC (RC-L, RC-M un RC-H) umkeprung fon en LH1 antene. Ti 2,80-A struktur fom komplëks woo protukt-W ferliert, tsaycht 16 αβ-hetero-timer, woo en ferxlosne LH1-loop komplet um RC umfast, woo hier te RC-LH116 komplëks kenënt kept. Ti 2,65 Å struktur fom protukt-W-komplëks hot en 14-hetero-timer LH1 woo fon protukt-W uner keproch kept, woo hier RC-LH114-W kenënt kept.
(A un B) Owerflëchlich representatsioon fon te komplët. (C un D) Kexpant pigmente woo in xteen aus kexproch wëre. (E un F) Ti komplëxe woo fon te sitoplasma oopjektiif peopacht kep sin, hon ti peptiise un LH1-unerxiitliche ërepxafte woo in te karikatuure representeyert kep sin, un sin noo te uer tsayt fon te protuktsioons-W-xpiichle numeriert kep [konsistent mit Rba-numerierung]. sfëre komplëks (13)]. Fer LH1-α, ti farp fon te proot unerxtitsung is keel; fer LH1-β, ti farp fon te proot unerxtitsung is blau; fer proot-W, is tas proot roote; fer RC-H, is tas xwayn; fer RC-L, is tas Oranje; fer RC-M, een magenta. Kofaktore sin torich xteen representeyert kep, kreen representeyert BChl un BPh a moleküle, lila representeyert karotenoide, un keel representeyert UQ10 moleküle. (G un H) Ferkreest aansicht fon te proot-W xpits puuch in te ëkwiwalënt rechioon fon RC-LH114-W komplëks (G) un RC-LH116 komplëks (H). Kofaktore sin in te form fon raum fële ketsaycht kep, ti chelate kinone sin in blau ketsaycht kep. Ti protuktsioon fon proot-W is mit en xtraal xtraal in (G) markiert kep, un ti kleene lëcher woo ti quinone/kinolol uf em LH116 ring xtraalt, sin mit en xwarts xtraal in (H) markiert kep.
Ti fikuur 1 (A un B) tsaycht ti RC umkeprung fon ufne ore ferxlosne xpiichelcher fon LH1αβ heterodimer, woo yeete eene tswaay BChl un een karotenoide ferpint (Fikuur 1, C un D). Fërtich xtuutium hot ketsaycht tas Rps te LH1 komplëks is. In te biosintesis weech fon te spirulina xantin, hon ti sorte kemixt populatsioone fon karotenoide (17). Awer, te spiropiroxantiin is te dominante karotenoide un sayn tichtkheet is tsufriite lose. Tës wëche, hon mer raus kesuucht spiroxanthin in ale LH1-petaytungs sites modeleere. Ti alfa un beta polipeptiise sin eensiche TMHs mit khortse membraan auswënich rechioons (Figura 1, A, B, E, un F). Opwool ti ticht fon 17 resisteente in te C-terminus net ketsaycht kep waar, is te alfa-polipeptiit fon Met1 pis Ala46 in te tswaay komplëxe kexnit kep. β-polipeptiid waar fon Gly4 pis Tyr52 in RC-LH116, un fon Ser5 pis Tyr52 in RC-LH114-W. Keweenlich is khee tichtkheet fon 3 ore 4 N-terminaale ore 13 C-terminaale resisteente ketsaycht kep (Figura S1). Mass spektrometrii analyse fon te kemixt RC-LH1 komplëks woo fom wilt tier xtam foer kexlaa kep waar, hot ketsaycht tas ti ferxwunene rechioon tas resultaat fon heterolooke xliisunge fon tëne peptiise waar (Figura S1 e S2). Ti N-terminal formylatsioon fon α-Met1 waar aach ketsaycht kep (f). Ti analyse hot ketsaycht tas te α-peptiit fon te resisteente fMet1 pis Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, un te β-peptiid fon te resisteente Ser2 pis Ala53, was in en kuute ërepxaft mit te niter-temperatuur EM-tichtkheet karte is.
Koortinatsioon fon α-His29 un β-His36 macht tas ti BChls sich foer xtele; yeete αβ-hetero-timer tuut sich mit sayn neekste fersamle fer en ufne loop (RC-LH114-W) ore en ferxlosne loop (RC-LH116) um te RC rom Te eksitoon-kopulatsioons xpiichel fon te pigment matrix (Figura 1, C e D). Im ferklaych mit te 877 nm xtraal tirektsioon fon RC-LH114-W, is ti 880 nm xtraal tirektsioon fon RC-LH116 3 nm (Figura 2A). Awer, te sirkulaare tikroismus spektrum is kans ti selwich (Figura 2B), was tsaycht tas, opwool es en klaare unerxiit kept tswixe ufne un ferxlosne loope, ti lokale umwantung fon BChls is kans ëkstra. Ti apsortsioons roote xpiichel khan tas resultaat sin fon te reduktsioon fon te thermixe xpiichelcher un ti ferkreesung fon te stabiliteet uf te ferxlosne xpiichel (18, 19), ti ënerung fon te pigment kopulatsioon woo fon te ferxlosne xpiichel kefaar kept (20, 21), ore en kombinatsioon fon tëne tswaay efekte (11).
(A) Ultraviolete/sichtbare/naach-infraroote apsortsioons spektrum, woo ti xpitse fon tëne mit sayn entsprechende picher markiert sin un normaliseyert kep sin fer te BPh-peech uf 775 nm. (B) Sirkulaar tikroismus spektrum normaliseyert fer BChl-apsortsioon in 805 nm. (C un D) Aus kesuucht ΔA xpektre fon te tsayt-resolweyert apsortsioons xpektre fon RC-LH114-W komplëks (C) un RC-LH116 komplëks (D). Fer pëser ferklaychung, kewe ale xpiichle normaliseyert uf ∆A fon −A uf 0,2 ps. (E) Ti rate fon te citokrom c2 oksiijen noo xtralung in te presëns fon ferxiitne konsentratsioone fon UQ2 (siit Fiktsioon S8 fer ti raue data). (F) In xëlcher woo uner niter, mittel ore hooch intensiteet licht kewakst hon (10, 30 ore 300μMm-2 s-1, respektiif), ti protuktsioon fon proote W un RC-L in te purifitseerte komplëks un ti separatsioon fon te membraan fertiint. Bestimmung fon te protuktsioons niwel torich SDS-poliakrilamid-Kel-Elektroforesis un Imuno-Assay (siit Fiktsioon S9 fer ti raue data). Bestimmung fon te ferklaychung relatiif tsum purifitseerte RC-LH114-W komplëks. Ti xteen fon RC-L fer proot-W fom komplëks is 1:1.
Ti BChls in te positsioon 1 in te ferxtëntnis fon te αβ14 loop fon RC-LH114-W (Fikuur 1, A, C, un E) sin 6,8 Å tichter an te RC priimer xpits puuch (P) wii ti ëkwiwalënt BChls in RC-LH116 (Fikuur 1, B un S3); awer, ti transiente apsortsioons kinetik fon te tswaay komplëxe tsaycht tas fer RC-LH114-W un RC-LH116, ti eksitatsioons enerjii transfusioon tsayt konstante fon LH1 pis RC sin 40 ±4 un 44±3 ps (Figura 2). , C un D, ​​Fikuur S4 un Tawel S2). Es kept aach khee signifikante unerxiit in te eletroonixe transfusioone iwer ti RC (Figura S5 e ferwante suplementaare tëkste). Meyer ferxteen tas ti ticht korrektsioon fon te enerjii iwertragung tsayt tswixe LH1 un RC-P is weeche te selwiche tistans, winkel un potensial enerjii fon te meyerxte BChl in te tswaay LH1 loope. Es siit aus tas ti LH1 enerjii musterum erkhëne fer ti minimum tistans se erkhëne, net xnël is wii ti direkte enerjii iwertragung fon te suboptimaale sites noo RC. Ti oopne loop LH1 loop in RC-LH114-W khan aach en unkeweenlich thermixe mowimënt uner niter xtele fer ti strukturaal analyse, un es kept en lënger αβ14 ring konformatsioon in te kamare temperatuur fon te pigmentatsioons tistans fon βBChls in te positsioon fon RC 1.
Tas RC-LH116 komplëks hot 32 BChls un 16 karotenoide, un sayn kans aanxtrëngung is ti selwich wii tii woo fon te Thermochromatium (Tch. (12) un grüne algues (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Noch noo te aanpasung, sin ploos kleene ënerunge in te positsioone fon αβ-hetero-timer ketsaycht kep, hauptseechlich 1-5, 15 un 16 (Figura S6). Ti presëns fon proot-W hot en important influëns iwer ti struktur fon LH1. Sii sin tray TMHs torich khortse loope ferpun, mit em N-terminal uf te lumen sayt fom komplëks un te C-terminal uf te citoplasma sayt (Figuras 1A e 3, A pis D). Protein-W is fer ti kans welt hydrofoop (Figura 3B), un TMH2 un TMH3 interakteere mit LH1αβ-14 fer en transmembraan oopjekt se forme (Figura 3, B un E pis G). Ti interfëys is hauptseechlich fon Phe, Leu un Val resisteente in te transmembraan rechioon komponiert kep. Tiise resisteente sin mit hydrofobixe amino asiate un αβ-14 pigmente kextëkelt kep. Welche polaare resisteente tuun aach ti interaktsioon mit hale, tepay ti waserstof ferpintung tswixe W-Thr68 un β-Trp42 uf te oopst peem fon te komplëks hols (Figura 3, F un G). Aan te oopst peem, is Gln34 neekst ti keto-krupe fon αβ-14 karotenoide. Tsum payxpiil, ti n-dodecil β-d-maltosiid (β-DDM) molekül is uf kexpant kep, un sayn hydrofoop xwayn hot sich ferprayt pis an ti interfëys tswixe proot-W un αβ-14, un te lipide xwayn khan im khërper xteen. Meyer hon aach kemërkt tas ti C-terminal resolutsioons rechioon fon te protuktsioon fon protukte W un RCH kans ticht paysamer sin, awer net in te xpiichel fon te spetsiifixe interaktsioone forme (Figura 1, A e E). Awer, es khan sin tas es interaktsioone in te unerxiitliche C-terminaale amino asiate fon tëne tswaay protukte kept, was en mechanisme fer ti rekrutatsioon fon protukte-W in te fersamlung fom RC-LH114-W komplëks protutseere khan.
(A) Protein-W, woo ti interfëys mit LH1αβ14 in karikatuer form foer xtele tuut, hot en xteen-fërtich sayte ketrënk (rot), woo in en teel fon te elektrostaatixe potensial diagram ketsaycht kept (transparent xwayn oopst peem mit en kontur niwel fon 0,13). (B) Protein-W representiirt fon een hydrofobixe farwiche oopst peem. Polaare un layt woo uf kexpant sin, sin in xwayn farwe ketsaycht kep, ti hydrofobixe sin in ways, un ti xtarke hydrofobixe sin in oranj. (C un D) Proot-W woo in te karikatuer ketsaycht kept, sayn orientiirung is ti selwich wii in (A) (C), un is mit 180° kexnit kep (D). Tëm noo ti positsioon in te sekwëns, tuun ti unerxiitliche resisteente en reenboom farwe aan nëme, woo te N-terminal blau un te C-terminal roote is. (E) Proot-W in te selwich siit wii in (A), un ti resisteente an te interfëys fon proot-W:LH1 sin fon xteen mit aankexlosne marke representeyert kep. (F) Proot-W is 90° kexnit kep, relatiif tsu (E) un LH1αβ14 in te karikatuer representatsioon, un relatiif tsu te interfëys resisteente in te xtraal representatsioon. Ti iwerxwëmungs resisteente fon te beta-polipeptiid sin markiirt. Te kofaktoor is als xtraal ketsaycht kep woo ti farwe fon te fikuur 1 aan nëmt, te entfërnungs β-DDM is in xwayn, un te sauerstof is in roote ketsaycht kep. (G) Ti siit in (F) is 180° kexnit kep, mit te prominënte resisteente fon te marke alfa polipeptiid.
Protein-W ersëtst en αβ-heterotimer (te 15. in te fikuur 1F), un soo, ferhëngert ti loop ferxlus un ti eyerxte tray αβ-heterotimer xtele. Es waar ketsaycht kep tas te maximaal inklinatsioons winkel fon te eyerxte αβ-1 heterotimer relatiif tsum film normaal 25° pis 29° waar (Fikuur 1, A un E), was keformt kep waar fon te 2° pis 8° inklinatsioons winkel fon αβ-1 in RC A xpits kontrast-LH116 unF. Ti tsweet un trite hetero-timere sin 12° pis 22° un 5° pis 10°, respektiif. Weeche te sterixe hiinkepung fon RC, ti xpits fon αβ-1 macht net tas tsweete paar αβ (woo te 16. αβ in te fikuur 1F entspricht), soo tas en klaare xpits puuch in te LH1 ring (fikuur 1, A un E) . Weeche te manktum fon tswaay αβ-heterotimere, mit em ferlust fon fier BChl un tswaay karotenoide, kept khee fon te karotenoide sich an ti ferxwunene αβ-1-unerxiitliche ërepxafte ferpint, was en LH114-W ring pringt woo 13 karotenoide Vegetarixe un 28 BChls enthëlt. Ti lokale resolutsioons xtimatsioone fon te tswaay komplëxe in te αβ1 pis 7 rechioon sin niter khom wii tii fon te rest fon te LH1 loop, was ti inerlich plastisiteet fon te LH1 subunit neekst ti RC QB site reflekteyert khan (Figura 4) .
Ti pilter fon RC-LH114-W (A un B) un RC-LH116 (C un D) sin fon te selwiche top/siit (A un B) (A un C) un fon te hols khaste fon te Fiktsioon 1. (B un D) ketsaycht kep. Ti farwiche xpiichle sin uf te rechts sayt ketsaycht.
Te eensiche anere karakteristixe kerneel komplëks mit en xteen fon 1:14 is te Rodokoks Sfaeroide (Rba.) RC-LH1-PufX-Dimer (13). Awer, te proot W un PufX hon khee klaare homoloxii, un hon en simpoolix influëns iwer sayn respektiiwe LH1 strukture. PufX is en eensichste TMH mit en N-terminaal citoplasmatik domain woo mit te sitoplasmatik sayte fon te RC-H-unerxiit (13) in en positsioon woo Rps entspricht, interakteert. 116αβ-16. PufX macht en kanal fer te kinoon/kinoon austausch tswixe RC-LH1 un te tsitokrom bcl komplëks un is in ale Rba present. sfaeroide kern komplëks (13). Obwohl ti monomer-monomer-interfëis in Rba is. Ti sfeere RC-LH1-PufX timer sin in te xpanungs positsioon fon te protuktsioon fon protukte W in RC-LH114-W, un ti xlisel woo fon PufX un protukt-W indutsiert kept, is in en ëkwiwalënt positsioon (Figura S7A). Ti xprooch in te RC-LH114-W is aach mit em hypothetixe khërwer kanal (8) fon Pseudomonas rosea LH1, woo fon peptiise keformt kept woo net mit protukt W ore PufX ferpun kept (Figura S7B). Ausserdem, te quinone kanaal in Blc. Ti smaragd-kroos LH1 woo keformt kep waar torich ausxlus fon en γ-unerxtitsung (7) is in en sëlwich positsioon kextelt kep (Figura S7C). Opwool se fon unerxiitliche protukte fermixt kewe, ti ausxtëlung fon tëne kinone/kinolol kanale in en kewoonlich positsioon im RC-LH1 komplëks xteet als en payxpiil fon konwersatsioons ewolutsioon, was tsaycht tas ti xpanung woo fom protukt W kemacht kept, als kinone kanal xafe khan.
Ti xlisel in te LH114-W loop erlaupnis fer ti forterung fon en kontinuum fon membraan rechioon tswixe te interne raum fon te RC-LH114-W komplëks un te xlisel membraan (Figura 1G), anxtat ti tswaay domain torich en protukt porem wii in protukte ferklayche. Te RC-LH116 komplëks is ëkstra fer een ferxlosne Tch. Nadel-wii komplëks (22) (Figura 1H). Wayl ti difusioon fon te kinone torich ti membraan xnël is wii ti difusioon torich te xmal protuktsioons kanal, khan ti ufne LH114-W loop xnël RC umkeen erlaupe wii ti ferxlosne LH116 loop, un ti difusioon fon te kinone in te RC khan mee inkexpërt sin. Um se proope op te protukt W ti konwersatsioon fon te kinone torich RC petreft, hon mer en sitokrom oksiijen test kemacht uf en pextimte konsentraatsioon fon ubikinone 2 (UQ2) (en analoog fon natierliche UQ10 mit en khortse isopren xpits) (Figura 2E). Opwool ti presëns fon chelaat kinone ti aktuaal petaytung fon te xpiichle fon te Michaelis Konstante hinerkeen (RC-LH114-W un RC-LH116 sin ti 0,2±0,1μM un 0,5±0,2μM, respektiif), is ti maximaal rate fon RC-LH114-6W-1. 28±5% kreeser wii RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Meyer hon aanfangs kexproch tas proot-W in unkefeyer 10% fom kerneel komplëks present is (16); hier, ti petaytungs rate fon te niter-licht, mittel-licht un hooch-licht wakstum xtele sin 15±0,6%, 11±1% un 0,9±0,5, respektiif % (Figura 2F). Kwantitatiif ferklaychung fon te mass spektrometrii hot ketsaycht tas ti aankhom fon te histoorixe xpiichelcher net ti relatiif abundans fon protukte-W ferklaycht mit te wilt tiere (P = 0,59), soo tas ti niwele net en artefakt sin fon modifitsierte protukte-W (Figura S10). Awer, tiise niter xtele fon te protuktsioon fon proot-W im RC-LH1 komplëks khan erlaupe tas etliche RCs sich in en akseleratsioons rate fliise, was te langsamer kinoon/kinolon austausch im RC-LH116 komplëks mititiert. Meyer hon kemërkt tas ti hooch licht pesuuchs rate inkonsistent is mit te rexënt transkriptsioons data, was tsaycht tas ti pufW-gene ekspresioon sich ferkreest uner xtarke licht (Figura S11) (23). Te unerxiit tswixe pufW transkriptsioon un protukt-W influëns in te RC-LH1 komplëks is ferkheert un khan ti komplëks rekularisierung fom protukt reflekteere.
In RC-LH114-W, kewe 6 kardiolipine (CDL), 7 fosfatidilkoliin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) un 29 β-DDM moleküle ketsaycht un in tëm sin 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POβDMs un 12 modeleyert kep. RC-LH116 (Fikuur 5, A un B). In tëne tswaay strukture, is CDL xon neekst uf te sitoplasma sayt fom komplëks, wën POPC, POPG un β-DDM sich hauptseechlich uf te luminal sayt fine. Tswaay lipide un waser moleküle sin in te αβ-1 pis αβ-6 rechioon fom RC-LH114-W komplëks isoliert kep (Figura 5A), un 5 sin in te ëkwiwalënt rechioon fon RC-LH116 isoliert kep (Figura 5B ). Mee lipide sin uf te aner sayt fom komplëks kefun kep, hauptseechlich CDL, woo tswixe RC un αβ-7 pis αβ-13 aankesammelt kep sin (Figura 5, A e B). Anere strukturaal resolweyert lipide un waser xpiichle sin ausserhalb fom LH1-ring, un ti kuut resolweyert asyle khëte xtreeme sich tswixe LH1-unerxtitsungs mitel, woo tentatiif als β-DDM in RC-LH114-W kenënt kept, un woo als β-DDM in RC A mixung fon βPOPC-DHDM un 160 definiert kept. Ti ëkstra positsioone fon te xlisel lipide un ti xlisel fon te xlisel in unser struktur tsayche tas se fisiolookix relewant sin fer ti xlisel fon te xlisel (Figura S12A). Ti positsioone fon te ëkwiwalënte moleküle in Tch hon aach kuute konsistens. Sanft un Trv. Ti xtam 970 RC-LH1s (Figura S12, B pis E) (9, 12) un ti waserstof-petaytungs resisteente fon te lipide khop krupe hon en kans kuut konserweerung in te sekwëns fon te xprooche ketsaycht (Figura S13), was tsaycht tas Konserweyert CDL woo an RC (24) konserweyert kept, tiise sites khan ti komplët-KHRCx konserweyert kewe.
(A un B) RC-LH114-W (A) un RC-LH116 (B) peptiise sin torich karikatuure ketsaycht kep, un ti picher sin torich xteen ketsaycht kep, mit te farwe fon te farwe in te fikuur 1. Ti lipide sin in roote farwe ketsaycht kep, un ti waser xtraus sin in xwayn farwe ketsaycht kep. UQ ferpint mit RC QA un QB sites is keel, wën isoliert UQ is blau. (C un D) Ti selwiche siënse wii (A) un (B), mit lipide aus kelos. (E pis G) Ferkreest siit fon Q1(E), Q2(F) un Q3(G) fon RC-LH116, mit sayte kexënke woo sich influëntsiire. Ti waserstof xteen sin wii xwarts xtraus ketsaycht.
In RC-LH116, sin tswaay RC QA un QB UQ, woo in te eletroone transfusioon in te layt separatsioon protses mit hale, in sayn ferpintungs sites ferxwun. Awer, in RC-LH114-W, is te QB-Kinoon net uf kehoop kep un wërt noch mool in tetayles pexproch kep. Neekst ti kanse QA un QB-Khinone, sin tswaay kexënke fon te UQ-moleküle (woo tswixe te RC un LH1-ringe sin) in te RC-LH114-W-xtruktur kextëlt kep noo tëne sayn kuut resolweyert khop krupe (woo in Q1 un Q2, respektiwlich, xteen). raum). Fikuur 5C). Tswaay isopreen eenheete sin fer Q1 kexrip kep, un ti tichtkheet karte resolweyert ti komplete 10 isopreen xpitse fon Q2. In te struktur fon RC-LH116, sin tray kexënke fon UQ10 moleküle (Q1 pis Q3, fikuur 5D) uf kehoop kep, un ale moleküle hon en klaare tichtkheet iwer te kanse xpits (fikuur 5, D pis G). In te tswaay strukture, hon ti positsioone fon te khiner khop krupe fon Q1 un Q2 en ekselënt konsistens (Figura S12F), un tii interakteere ploos mit RC. Q1 is an te ën fon te W-xpits puuch fon RC-LH114-W (Fikuur 1G un 5, C, D un E), un Q2 is in te ticht fon te QB-Binding Site (Fikuur 5, C, D) un F). Ti konserweyert L-Trp143 un L-Trp269 resisteente sin kans ticht pay Q1 un Q2 un pringe potensial fer π-stapel interaktsioone (Figura 5, E un F, un Fiktsioon S12). L-Gln88, 3,0 Å fom tistaal oksiijen fon Q1, kept en xtarek waserstof ferpintung (Figura 5E); tiise resistens is in ale RCs konserweyert kep, ekstra in te ferxiitne relatsioone (Figura S13). L-Ser91 is konserwatiif fer Thr in te meyerxte anere RCs ersetst kep (Figura S13), is 3,8 Angstrom fon te metil oksiijen fon Q1, un khan xwach waserstof ferpintunge protutseere (Figura 5E). Q3 xteet net foer als en spetsiifixe interaktsioon, awer is in te hydrofoop rechioon tswixe te RC-M un te LH1-α unerxtitsung 5 pis 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 un Q3 ore neekste chelate kinone sin aach in Tch resolweyert kep. Sanft, tas Trv. Stam 970 un Blc. Ti iris xtratus (9, 10, 12) tsaycht en konserweyert hilefs xtraal fon te RC-LH1 komplëks (Figura S12G). Ti 5 ferxwunne UQs in RC-LH116 sin in kuute ferpintunge mit te 5,8±0,7 fon yeete komplëks woo pextimt kept torich hooch preserweerungs xpiichle (HPLC), wën ti tray ferxwunne UQs in RC-LH114-W sin niter khom wii Te kemeesichte weyert fon 6,2±0,3 in Q unsolweyert sin (Fig. struktuer.
Ti pseudo-symmetrixe L un M polipeptiise hon yeete eene 5 TMHs un forme en hetero-timer woo een BChl-timer, tswaay BChl-monomere, tswaay bakteriofage (BPh) monomere, un een net-Heme-Eyert un een ore tswaay UQ10-moleküle kombineert. Tort tëm noo ti presëns fon waserstof ferpintunge uf te terminaal ketoon krupe un sayn pekhante akkumulatsioon in Rps, kewe karotenoide in te M-unerxtitsung inkexrip, woo cis-3,4-dehydroorhodopin kenënt kept. Sorte (25). Ti auswënich membraan domain fon RC-H is an te membraan fon en eensichste TMH ferankert kep. Ti kans RC-xtruktur is ëkstra fer ti tray unerxiitliche RC fon te ferwante sorte (wii Rba). sferoide (PDB ID: 3I4D). Ti makrotsikle fon BChl un BPh, te karotenoide xpits puuch un net-heeme xpits puuch, tuun sich iwerlaype iwer ti resolutsioons xpiichel fon tëne xpitse, soo wii ti UQ10 khop krupe uf em QA-Plats un ti QB-Khinone uf em RC-LH116 (Figura S15).
Ti disponibiliteet fon tswaay RC-xtrukture mit unerxiitliche QB-Site-Okkupatsioons Rate kept en nay oportuniteet fer ti konsistens konformatsioons ënerunge woo mit te QB-Kinone-Binding begleete, se xtuteere. Im RC-LH116 komplëks, is te QB-Kinoon in te kans ferpintung “proksimaal” positsioon (26), awer ti separatsioon fon RC-LH114-W hot khee QB-Kinoon. Es kept khee QB-Kinoon in RC-LH114-W, was ferwunert wayl te komplëks aktiif is, mee wii te RC-LH116 komplëks mit strukturaal resolweyert QB-Kinoon. Opwool ti tswaay LH1 ringe ungefeer seks kinoone chelate, sin 5 struktureel in te ferxlosne RC-LH116 ringe, wën ploos tray struktureel limiteyert sin in te oopne RC-LH114-W ringe . Ti ferkreest strukturaal xwiirichkheet khan ti xnël ersatz fon RC-LH114-W QB sites, ti xnël kinetik fon te kinone in te komplëks, un ti ferkreest protuktiwiteet fon te LH1 loop xtreet reflekteere. Meyer saan tas te manktum fon UQ in te RC QB-Site fon RC-LH114-W khan tas resultaat sin fon en komplëks un aktiif komplëks, un te QB-Site fon RC-LH114-W is klaych in te UQ-umsetsung ferfluucht kep Ti spetsiifixe xrit (te influëns fon te QB-Site is ti konformatsioon ferxlos kep) ref.
Oone QB, ti begleitungs rotatsioon fon L-Phe217 in en positsioon woo inkompatibel is mit UQ10-petaytung, wayl tas en xpanungs kollisioon mit te eyerxte isopren eenheet fom xwans pringt (Figura 6A). In tëm selwiche momënt, sin ti klaychmeesiche haupste konformatsioons ënerunge klaar, hauptseechlich ti helix de (kurte helix in te loop tswixe TMH D un E) woo L-Phe217 in te QB-petaytungs tas un ti rotatsioon fon L-Tyr223 (Figura 6A ) Fer ti waserstof-petaytungs-frame fon te QB-petaytungs-frame se breke. site (Fikuur 6B). Helix de pivote in sayn basis, te Cα fon L-Ser209 is 0,33Å ferxwun, wën te L-Val221Cα 3,52Å ferxwun is. Es kept khee peopachtungs ferënerunge in te TMH D un E, woo in te tswaay strukture iwertraut kewe (Figura 6A). Soo wayt wii mer wise, is tas ti eyerxt struktur in te natierliche RC woo ti QB-Site xliist. En ferklaychung mit te komplete (QB-petaytungs) xtratus tsaycht tas eep ti xtraal tichter khomt, en konformatsioons ënerung neetich is fer tas xtraal in te xtraus rin keen. L-Phe217 xpiirt sich rotiert fer en π-stapel interaktsioon mit te kinone khop krupe se forme, un ti helix xpiirt sich noo auswënich, was te xkeleet fon L-Gly222 un ti sayte ketrënk fon L-Tyr223 erlaupnis kept fer en waserstof-klaytungs network mit en staapel waserstof-klaytungs struktur se forme (Figura 6, A un C).
(A) Iwerlaypungs karikatuer fon hologram (L-ketrënk, oranj/M-ketrënk, magenta) un apo (grau) struktur, in was ti xlisel resisteente in te form fon en xtok-wii-representatsioon ketsaycht kewe. UQ10 is een keel xtraus representiirt. Ti punkte tsayche ti waserstof xpiichle woo in te kans struktur keformt sin. (B un C) Ti oopst peem fon te apolipoprotein un ti kans ring struktur, woo ti sayte ketrënk oksiijen fon L-Phe217 in blau un L-Tyr223 in roote, respektiif. Ti L unter eenheet is oranj; ti M un H unerxiite sin nët farwich. (D un E) Apolipoprotein (D) un kans (E) RC QB-Siite [farwe fon (A) respektiif] un Thermofilus PSII (kroos, blau mit plastik kinoon; PDB ID: 3WU2) Aanrichtung (58).
Unkewaart, opwool fiile strukture fon QB-defitsiente RCs oone LH1 eksistiire, sin ti konformatsioons ënerunge woo in tiise xtuutium ketsaycht kep sin, net foer heyer kexproch kep. Tas sin ti QB-depletsioon struktur fon Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) un Rba. sfaeroide (PDB ID: 1OGV) (29), woo al neekst ti selwiche sin wii sayn kans QB-xtruktur. Ti ticht inspetsioon fon 3PRC hot ketsaycht tas LDAO (Lauryl Dimetil Amin Oxide) ti xwayn moleküle sich an te ën fon te QB positsioon aan kewe, was ti rexpekt fer ti ferxlosne konformatsioon ferhëngert khan. Opwool LDAO net in te selwich positsioon in 1EYS ore 1OGV ferxwint, kewe ti RCs foer kexlaa mit te selwich waser xprits un khan tesweche te selwiche efekt pringe. Ti kristal struktur fon Rba. Sfaeroides RC ko-kristalisiert mit sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) xteen aach foer als en ferxlosne QB-Site. Awer, in tëm kast, ti N-terminal rechioon fon te RC-M polipeptiit (interaktsioon mit te QB-petaytungs site torich ti H-petaytungs site fon te Tyr-resistens uf te Q-helix) nëmt en unkeweenlich konformatsioon aan, un ti QB-konformatsioons ënerung is net mee erkhënt kep (30 ). Was uns ruich macht, is tas mer net tiise sort ferformung fon te M polipeptiit in te RC-LH114-W xtraal kesiin hon, was neekst tas selwiche is wii ti N-terminal rechioon fon RC-LH116 RC. Es sol aach ketsaycht kewe tas noo te ausxtëlung fon te LH1 antene, woo ti apolipoprotein RCs in te PDB uf kexpant hot, sin uf kehoop kep, was ti interne khërwer un ti lipide in te xpanung tswixe te RC un te inerlich oopst peem fon te umlitungs LH1 ring eliminiert hot (31, 32). RC kept funktsioonsfërtich wayl se ale kofaktore erhalt, ekstra ti ferxtëntnis fon te QB-Kinone, woo weenicher staapil is un woo oft ferloer keet im foerperaytungs protses (33). Tsum payxpiil, is es pekhant tas ti entfërnung fon LH1 un natierliche tsiklixe lipide fon RC en influëns hon khan uf ti funktsioone, wii ti ferklaychung fon te leewens tsayt fon te layt-separatsioon P+QB-staat (31, 34, 35). Tesweche, spekuleere mer tas ti eksistentsial eksistentsial fon te lokale LH1-Ring um te RC rom ti “xlos” QB-Site erhale khan, un soo, ti lokale Umwelt in te ticht fon te QB preserweere khan.
Opwool ti apolipoprotein (oone QB-kinoon) un ti komplete struktur ploos tswaay xpitse fon te umfang fon te QB-Site representeere, anxtat en serie fon ewënte, kept es indikatsioone tas ti ferpintung gate khan fer ti rexpekt fon te hydrokinoon ferhëngert Fer ti substraat inhiweyeere. Ti interaktsioon fon kinolol un kinoon in te ticht fon te QB-Site fon apolipoprotein khan anerxter sin, was pis an sayn apxlus fon RC nëmt. Es is lang tsayt foer kexlaa kep tas ti konformatsioons ënerunge en rol in te ferpintung un reduktsioon fon te kinone xpiile. Ti kapasiteet fon te ferfluucht RCs fer ti khiner noo te tunkel ataptatsioon se redukteere is ferxwakert (36); Xtraal kristalografii tsaycht tas tiise xwiirichkheet is weeche ti QB-Kinone woo in en “tistaal” konformatsioon fon 4,5 Å fon te aktiif proksimaal positsioon kefang kep sin (26) , 37). Meyer saan tas tiise tistaal ferpintung konformatsioon en xnaps fon te tswixe xtel tswixe apolipoprotein un te fol ring struktur is, woo ti aanfangs interaktsioon mit te kinone un ti uf pau fon te QB-Site noo keet.
Ti tip II RC woo im PSII komplëks fon ëtliche fototrofe bakterie un siëntifixe bakterie, algues un planse kefun kept, hot strukturaale un funktsionaale konserweerung (38). Ti strukturaal aanxtrëngung woo in te fikuur 6 (D un E) ketsaycht kept, xtelt ti ërepxaft tswixe PSII RCs un te QB-Site fon te Bakterie RC komplëks foer. Tiise ferklaychung is lang tsayt en modelo fer ti xtuutium fon te ticht ferwante sisteeme fon te kinone ferpintung un reduktsioon. Ti foerxritne puplikatsioone hon ketsaycht tas ti konformatsioons ferënerunge mit PSII reduktsioon fon te kinone pegleet kewe (39, 40). Tesweche, wën mer ti ewolutsioons konserweerung fon RC aan nëmt, khan tee foer heyer net peopachte ferpintungs mechanisme aach penutst kewe fer ti QB-Site fon PSII RC in oksiijen fototrofe planse.
Rps ΔpufW (unmarkiert pufW-xpiichlung) un PufW-His (C-terminal 10x His-markiert proot-W aus kexproch fon te natierliche pufW-lokus) xtame. palustris CGA009 waar in unser foerxritne aarwat pexrip (16). Ti xtame un ti isogene wilt tiire sin fon te friithoof raus kehool kep, torich en kleene numer fon xëlcher uf PYE (yeete 5 g liter -1) (in LB in -80 °C kexpaart kep, mit 50% ( w/v) glicerol) proot, hefe ekstrakt un suksinaat (% pla.)w agar/w [15]. Ti plats waar iwer ti nacht in te tunkelheet in te kamare temperatuur uner anaerobe kontitsioone inkexpërt kep, un tan mit ways licht (~50 μmolm-2 s-1) fer ti OSRAM 116-W halogen lampen (RS Components, UK) fer 3 pis 5 taache, pis en eensichst kolonii uf kextii is. En eensichst kolonii waar penutst kep fer 10 ml fon M22+ mittel (41) inokuleere, mit 0,1% (w/v) kasaminos asiate (hier M22 kenënt). Ti kultuur waar uner niter xtele fon te sauerstof konditsioone in te tunkelheet in 34°C mit 180 rpm fer 48 xtune kewakst, un tan is 70 ml fon te kultuur uner te selwiche konditsioone fer 24 xtune inkexpërt kep. En halpe aeroop kultuur mit en volumin fon 1 ml is penutst kep fer 30 ml M22-Medium in en 30 ml universaale xraupe-fërtich xtraus flayx inokuleere un mit xtraalente xtraale (~50μmolm-2 s-1) fer 48 xtune torich steriil magnetixe kraft Stirring rod. Tan sin 30 ml fon te kultuur mit unkefeyer 1 liter kultiweyert kep uner ti selwiche kontitsioone, was tan penutst kep waar fer ungefeer 9 liter kultuur in ~200 μmolm-2 s-1 fer 72 xtune inkexpërt kep. Ti xlisel sin torich sentrifugatsioon in 7132 RCF fer 30 minute keërnt kep, in ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0), un in -20°C kexpaart kep pis se neetich waare.
Noch noo em ausxlus, tuun mer phaar kristale fon te oksiijen I (Merck, UK), lysozym (Merck, UK) un tswaay fon te Roche-Holoenzym Protease Inhikeriche Tableete (Merck, UK) in ti resuspensioon fon te xlisel kexmis kewe. In een 20.000 psi franseesix preserweerungs xël (Aminco, USA), waare ti xëlcher 8 pis 12 mool ferxwun. Noo tëm ti unkebrochne xëlcher un unoploosliche xliselcher torich ti sentrifugatsioon fon 18.500 RCF fer 15 minute in 4°C raus kehool kep sin, is ti membraan fon te pigmentierte lysaat preserweyert kep torich ti sentrifugatsioon fon 113.000 RCF fer 2 xtune in 43.000°C. Ti oploos fraktsioon wërt ferxwun un ti farwiche membraane in 100 pis 200 ml tris-HCl (pH 8,0) lose un homogeniseere pis es khee sichtbare agregat kept. Ti suspensioon membraan is in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) inkexpërt kep, mit 2% (w/v) β-DDM fer 1 xtun in te tunkelheet in 4°C mit sanft xmier. Tan, 70°C sentrifukeere fer 150.000 RCF in 4°C fer 1 xtun uf lose, fer ti restliche unoplose wech xafe.
Ti solutsioons membraan fon te ΔpufW xtam waar uf en 50 ml DEAE Sepharose-Ioon austausch kolone mit tray kolone volumine (CV) fon te xpanungs puffer [20 mM tris-HCl (pH 8,0) woo 0,03% (w / v) β-DDM enthalt]. Wasch ti kholonne mit tswaay CV-petaytungs puch, un tan ti kholonne mit tswaay pextimungs pufcher woo 50 mM NaCl enthaale. Te RC-LH116 komplëks waar mit en lineaar xtraal fon 150 pis 300 mM NaCl (in te xtraal tirektsioon) uf 1,75 CV eluiert kep, un te restlich xtraal tirektsioon komplëks is mit en xtraal tirektsioon fon 300 mM NaCl uf 0,5 CV eluiert kep. Tas apsortsioons xpiichel tswixe 250 un 1000 nm samele, ti fraktsioon mit apsortsioons xpiichel (A880/A280) kreeser wii 1 uf 880 pis 280 nm hale, tswaay mool in te xpiichel puf fertiint, un ti selwich protses noch mool penutse uf te DEAE-Kolone On purification. Ti fraktsioone mit A880/A280 fertiinung heecher wii 1,7 un A880/A805 fertiinung heecher wii 3,0, mache ti trite xrit fom ioon austausch, un hale ti fraktsioone mit A880/A280 fertiinung heecher wii 2,2 un A880/A805 fertiinung heecher wii.0. Te teel-reinigung komplëks waar konsentreyert kep uf ~2 ml in en Amicon 100.000 molekulaare weech xnit (Merck, UK), un is uf en Superdex 200 16/600 xtek ausxlus kolone (GE Healthcare, US) kexmis kep, woo 200 ml puffer in te m 1,5 CV tas. Samle ti apsortsioons xpektre fon te kroos ausxlus fraktsioon, un konsentreere ti apsortsioons xpektre mit A880/A280 fertiinung iwer 2,4 un A880/A805 fertiinung iwer 5,8 pis 100 A880, un klaych penutse se fer ti krio-TEM xtraal foer peraytung ore xpanung neetichkheetChalt uf -til80.
Ti solutsioons membraan fon PufW-His xtam is in en 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sefarose Kolone (20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 200 mM NaCl un 0,03% (w/w)) in IMAC-Puffer ( GE) aan keprung kep. v) tas β-DDM]. Ti kholonne waar mit 5 CVs fon IMAC-Puffer kewaxt kep, un tan mit 5 CVs fon IMAC-Puffer woo 10 mM histiin enthalung hat. Te kerneel komplëks waar fon te kholonne mit 5 IMAC-Puffer woo 100 mM histiin enthalung hate, eluiert kep. Ti fraktsioon woo te RC-LH114-W komplëks enthalet, is konsentreyert kep pis ~10 ml in en xmier tank woo mit en Amicon 100.000 MWCO filter (Merck, UK) aus kestaalt kep waar, 20 mool mit te xmier puffer fertiint, un tan kept es 25 ml fertiint in te DEAE b Sephaur fer im foer xayn. Wasch ti kolone mit fier CV-petaytungs puffer, tan eluiert te komplëks uf acht CVs uf en lineaar xtraal fon 0 pis 100 mM NaCl (in te xpanungs puffer), un ti restlich fier CVs woo 100 mM xpanungs puffer enthaale Ti resistiwe komplëxe chlobin mit te sori8de2000. heechste wii 2,4 un ti A880/A805 fertiinung heechste wii 4,6 fraktsioone waare konsentreyert kep uf ~2 ml in en Amicon 100.000 MWCO sentrifugal filter, un mit 1,5 CV IMAC in te foerxrit Puffer ëkwilibriert Superdex 200 sise in te ausxlus puf un 16/600. 1,5 CV tas. Ti apsortsioons xpektre fon te kroos-eksklutsioon fraktsioone samele un ti apsortsioons xpektre mit A880/A280 xpiichelcher iwer 2,1 un A880/A805 xpiichelcher iwer 4,6 pis 100 A880, woo klaych penutst kewe fer ti ferfluucht TEM-xtraal foer peraytung ore kexpaart kewe pis -80°C.
En Leica EM GP imersioons friithoof waar penutst fer TEM-Raster mit niter xtele. Te komplëks waar in IMAC-Puffer fertiint kep mit A880 fon 50, un tan is 5μl uf en nay xlisel kexmis kep, woo QUANTIFOIL 1,2/1,3 karbon-kexnit kep waar (Agar Scientific, UK). Inkuweere ti xtraus in 20°C un 60% relatiif humixiteet fer 30 s, tan 3 s trokne, un tan in flëxich ethan in -176°C aus xtërwe.
Ti data fom RC-LH114-W komplëks sin uf em eBIC (Elektroonixe Bioimaging Centrum) (Britanixe Diamante Licht Quelle) mit en Titan Krios Mikroskoop kexrip kep, woo mit en akseleratsioons xpanung fon 300kV xaft, mit en nominaale ferkreesung fon 130.000 enerjii fon-V × un en nominaale ferkreeserung fon 130.000 gap aV. En Gatan 968 GIF Quantum mit K2-peech-detektoor is penutst kep fer pilter in te xprooch modus uf nëme fer ti data samele. Ti kaliipert pixel kroosheet is 1,048Å, un ti dosis rate is 3,83 e-Å-2s-1. Hot te film in 11 sekunte samer ketuun un hot tee in 40 teele keteelt. Tuu te karbon-petaytungs plats penutse fer tas mikroskoop noch mool uf phase, un tan, tuu tray filme pro loch samele. In te kans welt sin 3130 filme kesammelt kep, mit en xpits puuch fon -1 un -3μm.
Ti data fer te RC-LH116 komplëks sin mit te selwich mikroskoop fon te Asterbury Biostruktur Laboratoorium (Uniwersiteet fon Leeds, UK) kesammelt kep. Ti data sin in te xtellungs motiif mit en ferkreesung fon 130 k kesammelt kep, un ti pixel xpiichelcher sin kalifitseert kep uf 1,065 Å mit en dosis fon 4,6 e-Å-2s-1. Te film waar in 12 sekunte kexrip kep un waar in 48 teele keteelt kep. In te kans welt sin 3359 filme kesammelt kep, mit en xpits puuch fon -1 un -3μm.
Al ti data ferarwaytung is in te Relioon 3.0 pipeline kemacht kep (42). Motioncorr 2 (43) penutse fer ti xtraal tirektsioon torich ti xtraal tirektsioon se korrekteere, un tan penuts CTFFIND 4.1 (44) fer te CTF (kontrast transferëns funktsioon) parameter fest xtele. Ti tipixe fotomikrofoone noo tëne aanfangs protses sin in te fikuur 2. S16 ketsaycht kep. Ti automatix selektsioons xtel is kexrip kep torich ti manuel selektsioon fon unkefeyer 250 pixel fon 1000 partikele in en 250 pixel raam un khee referëns tswaay-xproochichkheet (2D) xtel, un soo, kewe ti xtelunge woo ti protuktsioons kontaminatsioon erfiile ore khee erkhënungs kharakteristike hon, ferwort. Tan, is ti automatix selektsioon uf ale mikrofoone kemacht kep, un te RC-LH114-W waar 849.359 partikele, un te RC-LH116 komplëks waar 476.547 partikele. Al ti auskesuuchte partikele hon tswaay runde fon net-referens 2D-klasifikatsioon uner kenom, un noo yeete runt, kewe ti partikele woo ti karbon area trefe, protuktsioons kontaminatsioon, khee klaychmeesiche xpiichelcher ore xtarek iwerxprechungs partikele ferwort, was 772.033 (90,9%) un 359.D578 fon partikele penutst kewe (359.6578 ) fon te partikele. RC-LH114-W un RC-LH116 in te richtung. Te aanfangs 3D referëns model is kexrip kep mit te hilef fon te stokastixe xtraal tiwersiteet methook. Wën mer te aanfangs model als referëns penutse, kewe ti auskesuuchte partikele in fier kateeoriie in 3D keteelt. Wën mer te model in tiise katee als referëns penutse, mache mer 3D-raffineerung uf te partikele in te kreeste katee, tan penutse mer te aanfangs 15Å niter-paas filter fer ti soltaate se tëke, 6 pixel fon te weech ranke hiner traan, un ti pixel noo-protses fer ti korrekt fon te Gatan K2 transfer funktsioon fon te top-peak Mo. Fer ti RC-LH114-W dataset, is tee aanfangs model modifitsiert kep, torich ti xtarek tichtkheet fon te xpitse fon te mask (entfërnung fon te kerneel komplëks tichtkheet in UCSF Chimera). Ti resultaate fon te modele (ti resolutsioone fon RC-LH114-W un RC-LH116 sin 3,91 un 4,16 Å, respektiif) sin als referëns penutst kep fer ti tsweet runde fon te 3D-Klassifikatsioon. Ti partikele woo penutst kewe, sin in te eyerxte 3D-klaas kexrip kep un hon khee xtarke korrektsioone mit te nachparxlayt. Overlap orer manktem fon klaychmeesiche strukturaale phunkte. Noch noo te tsweet runde fon te 3D-klassifikatsioon, is ti katee mit te hoochste resolutsioon raus kesuucht kep [Fer RC-LH114-W, is een katee 377.703 partikele (44,5%), fer RC-LH116, kept es tswaay kateeoriie, woo in te kans welt 260.752 partikele sin, in te kans welt sin ti W.552 sin. noo te aanfangs rotatsioon mit een kleen unerxiit]. Ti auskesuuchte partikele sin noch mool in en 400-pixel khaste raus kehool kep un torich 3D-raffinierung raffiniert kep. Ti soltaat mask is kexrip kep mit te hilef fom aanfangs 15Å niter-xtraal filter, 3 pixel karte ausxtëlung un 3 pixel weech mask. Mit te penutsung fon te CTF-raffinement pro-partikel, ti motsioons korrektsioon fon te pro-partikel un ti tsweet runde fon te CTF-raffinement, 3D-raffinement, soltaat maskeere un noo-ferarwaytung kewe noo yeete xrit kemacht fer ti resultaat fon te tekstur noch mool raffineere. Wën mer te FSC (Fourier Xtel Korrektsioon Koefitsiënt) xtek weyert fon 0,143 penutse, sin ti resolutsioone fon te ën modele fon RC-LH114-W un RC-LH116 2,65 un 2,80Å, respektiwlich. Ti FSC-kurwe fon te ën modele sin in te fikuur 2. S17 ketsaycht kep.
Al ti proote sekwënse sin fon te Uniwersiteet fon Oxford: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniprotID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (pufw; uniprotein ID: q6n1k3). SWISS-MODEL (45) is penutst kep fer en homolokii model fon RC se konstruiire, woo ti protuktsioons sekwënse fon RC-L, RC-M un RC-H un ti kristal struktur fon Rba enthalet. sphaeroides RC waar als vorlage gebruikt (PDB ID: 5LSE) (46). Ti “fit karte” tool in te UCSF Chimera penutse fer tas kexprochne model in te karte se pasëyere (47), ti protuktsioon fon protukte ferpesere, un kofaktoor [4×BChl a (monomer biblioteek resistens naame = BCL), 2×BPh a (BPH), een ore tswaay sorte UQ10 (U10), een net-heron un een net-heron) . 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] penutse Coot (48) fer se hëlfe. Wayl QAK net in te monomer biblioteek eksistiirt, is tee mit em eLBOW-Tool in PHENIX (49) parametriseyert kep.
Als nächstes, is ti LH1-unerxiit konstruiert kep. Am aanfang, waar tas automatixe konstruktsioons mitel in PHENIX (49) penutst kep fer en teel fon te LH1-Sekwëns automatix se konstruiire, mit te kartofle xtek un ti LH1-α un LH1-β protukt sekwens als input. Ti komplët LH1-unerxtitsung raus suuche, raus suuche un in Coot laate, ti ferkangne ​​sekwëns manuel in tëm, un ti kans struktur manuel raffineere eep mer tswaay BCls a (BCL) un en spirilloxanthin (CRT) [noo te relewante Rps Ti ticht fon te LH1 komplëks un te pekhante karoten inhalt. Sorte (17)]. Kopiere ti kans LH1-Unerxiitliche Unit, un penuts ti UCSF Chimera “Docking Map Tool” fer ti neekste net-moter xprooche fon te LH1-Tichtkheet, un tan raffineere se in Coot; repetiire te protses pis ale LH1-unerxiite modeleyert kep sin. Fer ti RC-LH114-W struktur, torich ti ekstraktsioon fon te unerxiitliche tichtkheet in te Coot, kept te protukt fon te restliche net-protukte komponiinte in te USCF Chimera Karte kexnit un te Autobuild-Tool is penutst kep fer te aanfangs model se estaliire, un ti restliche unerxtitsungs eenheete (protukt-W) Modeleere. In te FENIX (49). Tuu yeete ferkheerte sekwëns tsu te resultaat model in Coot (48) aan wëne, un tan ti kans unerxtitsung manuel raffineere. Ti restlich unerxiitliche tichtkheet pasëyert in te kombinatsioon fon te lipide (PDB-Monomer Biblioteek ID fon CDL = CDL, POPC = 6PL un POPG = PGT), β-DDM-Waser (LMT) un UQ10-Moleküle (U10). Ti PHENIX-Optimisierung (49) un ti manual Optimisierung in Coot (48) penutse fer tas kanse inwanerungs modelo perfekt mache, pis ti modelo-statistike un ti wisioons kwaliteet fon te fitnes net mee ferpesert kewe khëne. Tsum xlus, penuts LocScale (50) fer ti lokale karte se xraywe, un tan mache mer phaar anere xrit noo foran fer ti modeleerung fon te unerxiitliche tichtkheete un ti automatix un manuel optimiseerung.
Ti respektiiwe peptiise, kofaktore un anere lipide un kinone woo in tëne sayn respektiiwe tichtkheet aankhom sin, sin in te fikuure 1 un 2. S18 pis S23 ketsaycht kep. Ti statistixe informatsioone fom ën model sin in te Tawel S1 ketsaycht kep.
Wën net anere xprooche pextimt sin, sin ti UV/Vis/NIR-Apsortsioons Xpektre uf en Cary60-Spektrofotometer (Agilent, USA) kesammelt kep, mit 1 nm interwaale fon 250 nm pis 1000 nm un en intekratsioons tsayt fon 0,1s.
Ti protuktsioon in en kwarts kuut mit en 2 mm weech pis A880 fon 1, un samele te apsortsioons spektrum tswixe 400 un 1000 nm. Ti sirkulëre tikroose xpiichelcher sin uf en Jasco 810 xpiichelcher (Jasco, Japan) kesammelt kep, mit 1 nm xtraal tirektsioon tswixe 400 nm un 950 nm mit en xtraal rate fon 20 nm min-1.
Te molar ausxtëlungs koefitsiënt kept pextimt torich ti fertiinung fom kerneel komplëks in en A880 fon unkefeyer 50. Te 10μl fom volumen in 990μl fom xwayn ore metaan, un te apsortsioons spektrum klaych samele fer ti BChl-fertiinung minimiiseere. Ti BChl inhalt fon yeete metaan protukt waar ketseelt kep torich te ausxtëlungs koefitsiënt fon 771 nm fon 54,8 mM-1 cm-1, un te ausxtëlungs koefitsiënt is pextimt kep (51). Teelt ti kemeesichte BChl konsentratsioon mit 32 (RC-LH114-W) ore 36 (RC-LH116) fer ti kerneel komplëks konsentratsioon se pewayse, woo tan penutst kept fer tas apsortsioons spektrum fon te selwiche protukt woo in te puch Extinktsioon koefitsiënt samer ketuun kept. neewich. Drei repetitsioons meechlichkheete sin fer yeete protukt kenom kep, un ti tswixe apsortsioon fon te BChl Qy maximum is fer ti rechnung penutst kep. Ti ausxtëlungs koefitsiënt fon RC-LH114-W woo uf 878 nm kemeesert kept, is 3280±140 mM-1 cm-1, wën te ausxtëlungs koefitsiënt fon RC-LH116 woo uf 880 nm kemeesert kept, is 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 waar noo te methote in (52) kwantifitseert kep. Kurt, is ti HPLC fon te umkeen phase (RP-HPLC) kemacht kep mit te hilef fom Agilent 1200 HPLC-System. Ungefeer 0,02 nmol fon RC-LH116 ore RC-LH114-W in 50μl fon 50:50 metaan:chloroform mit 0,02% (w/v) fertiint, un ti foerxritne Beckman Coulter Ultrasfëre m6 m1-1 injekteere. 40°C in HPLC-Lös (80:20 Metanol:2-Propanol) uf en ×25 cm-Kolon. Isokraatixe elutsioon in en HPLC-Lösung mache fer ti apsortsioon fon 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoide) un 780 nm (BChl) fer 1 xtun kontroliire. Te xpits puuch in te 275 nm xpits puuch fon 25,5 minute waar intekriert kep, woo khee anere entfërnungs ferpintunge enthalung hot. Ti intekrierte areal is penutst kep fer ti molar numer fon UQ10 ekstraktiert mit te referëns fon te kalifikatsioons krupe woo fon te influëns fon te pure standarte fon 0 pis 5,8 nmol kexproch kep sin (Figura S14). Yeete protukt waar in tray replikatsioone analysiert kep, un te pekhante xrit entspringt te SD fom xrit.
En lësung woo te RC-LH1 komplëks mit en maximaal Qy-apsortsioon fon 0,1 enthalung hot, is mit 30 μM xwayn fom hëmes hërtslich c2 (Merck, UK) un 0 pis 50 μMUQ2 (Merck, UK) foer kexlaa kep. Drei 1-ml protukte sin an yeete UQ2 konsentratsioon foer kexlaa kep un sin iwer ti nacht in te tunkelheet inkexpërt kep uf 4°C, tas ti komplete aanpasung an ti tunkelheet foer te meetche sicher kehal kep waar. Ti lësung waar in en OLIS RSM1000 modulaar spektrofotometer kexmis kep, woo mit en 300 nm flam/500 linye xtraal, 1,24 mm influëns, 0,12 mm mittel un 0,6 mm aus xlits aus kestaalt kep waar. En 600 nm lang pas filter kept an te entrës fon te protuktsioons foto un ti referëns foto multiplikatoor kextëlt fer ti eksitatsioons licht aus xlus mache. Ti apsortsioon waar uf 550 nm mit en intekratsioons tsayt fon 0,15 s ketsaycht kep. Ti erkhënungs licht kept fon te 880 nm M880F2 LED (Licht Emitente Dioda) (Thorlabs Ltd., UK) torich en faser optik kabel mit 90% intensiteet torich en DC2200 kontroleerer (Thorlabs Ltd., UK) aus kextraalt un is aus kextraalt kep in te licht kwel fon°0 in en. Te meetungs xtraal is keeche te xpiichle kextëlt kep fer yeete licht tsurik pringe woo am aanfang net fon te proop ap kehool kep waar. Monitor ti apsorptsioon 10 s foer ti licht fon 50 s. Tan is ti apsortsioon noch mool noo kekukt kep fer 60 s in te tunkelheet, fer se pewayse wii fiil te quinolol spontan te sitokrom c23 + redukteere tuut (siit ti fikuur S8 fer ti raue data).
Ti data sin ferprayt kep torich en lineaar aanfangs rate in 0,5 pis 10 s (ti UQ2 konsentraatsioon ap kexpant) un ti rate fon ale tray protukte in yeete UQ2 konsentratsioon in te mite. Ti RC-LH1 konsentraatsioon woo fon te respektiif ausxtëlungs koefitsiënt kexproch kep waar, is penutst kep fer ti xprooch in te katalytixe efisiëns se konwerteyere, woo in te Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) kexrip kep waar, un is in te modelo fon Michaelis-Menten kepast kep fer ti xpiichle fon te Km un Kcat weyerte se pewayse.
Fer ti transiente apsortsioons meechlichkheete, is ti RC-LH1 protuktsioon pis ~2μM in IMAC-Puchwer fertiint kep, mit 50 mM Natrium Askorbat (Merck, USA) un 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Askorpiin is als opfer eletroon donor penutst kep, un te tert-butaclofen is als QB-inhikerierter penutst kep, fer se sicher lose tas te haupste RC-donor redukteyert kept (tas petayt, net fotooksiteyert kept) iwer te kanse meetungs protses. Unkefeyer 3 ml protuktsioon kept in en xpits puuch kexnit (unkefeyer 0,1 m in te xpits, 350 RPM) mit en 2 mm optixe weech lëngte, tas ti protuktsioon in te laser weech kenuuch tsayt hot fer ti tunkel aanpasung tswixe eksitatsioons pulse. ~100-fs laser pulse penutse fer tas Ti: Safir Laser Sisteem (Spektra Fisik, USA) fer ti protuktsioon fon te protuktsioons xpiichelcher uf 880 nm in en repetitsioons rate fon 1 kHz (20 nJ fer NIR ore 100 nJ fer Vis) se xpiichele. Bevor ti data samele, tuut ti proop unkefeer 30 minute in te eksitatsioons licht aus xtële. Ti ekspositsioon tuut ti QA inaktiwiteet pringe (eventuaal QA een mool orer tswaay mool xmayse). Awer, tënkt mool noo tas tee protses rewersipel is wayl noo en lang tsayt fon tunkelheet aanpasung, RC tuut langsam tsurik in ti QA aktiwiteet keen. En Helios-Spektrometer (Ultrafast Systems, USA) is penutst kep fer ti xpiichle fon te xpiichle mit en ferxtëntnis tsayt fon -10 pis 7000 ps . Tuu ti Software Surfast Xplorer (Ultrafast Systems, USA) penutse fer ti data fon te layt se ënere, tan, tuu se fersamle un standartisiire. Ti softwaer pakeet CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituanien) penutse fer ti kombinatsioon fon te data sets penutse fer ti tiferensiaale xpiichle woo mit te ferxwinung se tuun hon, ore penutse en funktsioon woo meerere eksponënte mit te instrumënte antwort fer ti eensichst welt xpiichle ewolutsioon in OriginLa (Originb) se pasëyere.
Soo wii xon foer heyer kesaat kep waar (53), is en fotosintesis film foer kexlaa kep mit LH1 komplëks woo tswaay RC un perifere LH2 antene ferliert. Ti membraan is in 20 mM tris (pH 8,0) fertiint kep un tan is se in en kwarts kuut mit 2 mm optixe weech kexmis kep. En 30nJ laser puls is penutst kep fer ti protuktsioon fon te protuktsioons mitel uf 540 nm mit en ferxtëntnis tsayt fon -10 pis 7000 ps. Protses ti dataset wii fer Rps pexrip. pal proef tas.
Ti membraan is torich 150.000 RCF fer 2 xtune in 4°C kexnit kep, un tan is sayn apsorptsioon in 880 nm in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) un 200 mM NaCl resuspensiert kep. Ti membraan lose sich langsam in 2% (w/v) β-DDM fer 1 xtun in te tunkelheet in 4°C. Ti protuktsioon is in 100 mM triwer kexnit kep (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) pis an en protuktsioons kontitsioon fon 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad analyse). Witer ferarwaytung is fon te foer heyer puplitseyert methook kemacht kep (54), aankefang mit te fertiinung fon 50 μg proot in en kans 50 μl TEAB woo 1% (w/v) natrium lauraat (Merck, UK) enthalung hot. Noch noo 60 s, is se mit 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, UK) in 37°C fer 30 minute kexnit kep. Fer ti S-alkylierung, kewe ti protuktsioons mitel mit 10 mM metil S-metil sulfonaat (Merck, UK) inkexpërt un 10 minute in te kamare temperatuur kexmis. Proteolytixe fertiinung is kemacht kep torich 2 μg tripsin/endoprotein Lys-C mixung (Promega UK) un is in 37°C fer 3 xtune inkexpërt kep. Ti laurat surfaktant is raus kehool kep torich 50 μl etil asetat un 10 μl 10% (v/v) LC-Klasse trifluoro-acetaat (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) un 60 s. Ti phase separatsioon is torich ti sentrifugatsioon fon 15.700 RCF fer 5 minute promoweyert kep. Soo wii te protokol fom fabrikant saat, is en C18 xpits puuch (Thermo Fisher Scientific, UK) penutst kep fer ti uner phase woo tas peptiit enthalung hot, soriche un entsalse. Noch noo te troknung torich vakuum sentrifugatsioon, is ti protuktsioon in 0,5% TFA un 3% asetonitril kexlos kep, un 500 ng is mit nanofluus RP-chromatokrafii analysiert kep, mit mass spektrometrii, mit te penutsung fon te sisteem parametere woo foer heyer aus keleet kep sin.
MaxQuant v.1.5.3.30 (56) fer ti protuktsioon fon proote un kwantifikatsioon fer Rps suuche. palustris proteoma databank (www.uniprot.org/up000001426). Ti mass spektrometrii protuktsioons data sin in te Proyekt Hunsrik kexrip kep, torich tas PRIDE-Partner Repositoorium (http://proteomecentral.
Fer ti analyse torich RPLC kepaut mit elektro-xprits ionisatsioons mass spektrometrii, is te RC-LH1 komplëks fon wilt tiire Rps foer kexlaa kep. Mit te foer heyer puplitseyert methook (16), hot ti protuktsioon fon protukte woo in te palustris xëlcher protutseert kep sin, 2 ml ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl un 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad analyse) ) DDM. Soo wii te protokol fom fabrikant saat, penuts 2D-reinichungs kit (GE Healthcare, USA) fer 10 μg proot proot raus hoole torich ti preserweerungs methooke, un te preserweerungs methook in 20 μl 60% (v / v) fon te xwayn (FA), 20% (v / v) Acetonitril/vv (20% waser) uf lose. Fiif mikroliter sin mit RPLC (Dionex RSLC) kexproch kep, mit mass spektrometrii (Maxis UHR-TOF, Bruker). Ti MabPac 1,2×100 mm kolone (Thermo Fisher Scientific, UK) penutse fer ti separatsioon fon 60°C un 100μlmin -1, mit en xtraal fon 85% (v/v) soltaat A [0,1% (v/v) FA un 0,02% (V/v) Lösung B8/v a [0,1%(v/v) FA un 0,02%(v/v) in 90%(v/v) asetonitril TFA] Mit te penutsung fon te standart eletroonix xprits ionisatsioons xprits un ti xprits parametere fer mee wii 60 minute, kriit te mass spektrometer 100 pis 2750 m/z (mass-fertiint). Mit te hilef fon te ExPASy Bioinformatik Resourse Portal FindPept, kartoteere ti mass spektrum fon te unerxtitsungs eenheete fom komplëks.
Ti xtele waare 72 xtune lang uner 100 ml NF-niter (10μMm-2 s-1), mittel (30μMm-2 s-1) ore hooch (300μMm-2 s-1) licht kewakst. M22 mittel (M22 mittel woo ammonium sulfat aus kexproch kept un natrium suksinaat mit natrium asetat ersetst kept) in en 100 ml xraupe-top flax (23). In 5 30-s tsikle, sin 0,1 mikron xlisel kexnit kep in en volumin fertiint fon 1:1 fer ti xlisel se lyse un 5 minute uf em eyer kefërept kep. Ti unoploosliche materiaale, unkeprochne xëlcher un xlisel perle sin torich ti sentrifugatsioon fon 16.000 RCF fer 10 minute in en banch-mikro-sentrifugatsioon raus kehool kep. Ti membraan waar in en Ti 70,1 rotor mit 100.000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) mit en 40/15% (w/w) sukrose xtraal fer 10 xtune kexnit kep.
Soo wii in unser foerxritne aarwat pexrip kep waar, imunodetektsioon fon te His Taach uf PufW (16). Kurt, te purifitseert kern komplëks (11,8 nM) ore ti membraan woo ti selwich konsentratsioon fon RC enthalet (petaytung fon te oksiijen ferpintunge subtraktsioon fon te reduktsioon fon te ferxiitne xpiichle un ti last uf te farwiche xpiichle) in 2x SDS last puffer (Merck, UK) tswaay mool fertiint. Ti proote waare uf en replika fon 12% pisye xwayn fom NuPage (Thermo Fisher Scientific, UK) kexnit kep. En xël waar mit Coomassie Briljant Blau (Bio-Rad, UK) kefërept kep fer ti RC-L-Sub-Eenheet se laate un se visualiseere. Tas proot uf em tsweete xël is fer ti imuno-test fon te metaan-aktiwiteet membraan (PVDF) kexmis kep. Ti PVDF-membraan waar in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) tswixe 20 un 5% (w/v) xwayn-xwayn-pulwer inkexpërt kep, un tan is se mit te anti-His priimer antikörper (in puffer trin-H0p] inkexpërt kep. 7,6), 150 mM NaCl un 0,05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Laboratórios de Betil, USA) fer 4 xtune. Noch noo 3 mool fer 5 minute in antikörper puffer, is ti membraan mit xwayn peroksidaas (Sigma-Aldrich, UK) anti-muus sekuntaar antikörper (1:10.000 in antikörper puffer fertiint) W inkuweyert kep fer ti entfërnung erlaupe (5 minute noo 3 waser in antikörper puffer CESTA0). (Cyanagen, Italien) un Amersham Imager 600 (GE Kesuntheet, Reino Unido).
In te xtraal fon te intensiteet fertaylung fon yeete farwiche xël ore imuno-assay xtraal, intekriert ti area uner te xpits puuwe un berechne ti intensiteet fertiint fon RC-L (farwiche xël) un Protein-W (imuno-assay), in ImageJ (57) Protses tas pilt. Ti ferklaychunge sin in molar ferklaychunge konwerteyert kep, torich ti aan nëmung tas ti ferklaychung fon RC-L in te pure RC-LH114-W protuktsioon 1:1 waar un ti kans dataset too temit normaliseyert kep waar.
Fer ti erkhënung fon te materiaale fer tiise artikel, klikt uf te sayt fon te xprooch fon te layt woo in te xprooch fon te layt xpreche.
Tas is een artikel woo uf kexpant kep is uner te pextimte reekele fon te Liipe Petaytungs Liipe. Te artikel erlaupnis fer unerxiitliche penutsung, ferpraytung un reprotuktsioon in yeete mitel, uner te konditsioon tas ti orixinaal aarwayt richtich tsitiirt wërt.
Nootwëntich: Mëyer ferlange ploos tas tuu tayn e-mail adres këpst, tas ti persoon woos tuu ti site recomendast, wees tas tuu wilst tas tii ti e-mail siin un tas es nët spam is. Meyer tuun khee e-mail adresse fange.
Tiise frooch wërt penutst fer se proope ops tuu een pesuucher pist un fer ti automatix spam se ferhëngert.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Andrew Hirmail C.
Ti hooch resolutsioons struktur fon te licht trap 1 komplëks im reaktsioons sentrum kept naye insicht in ti kinone dynamik.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Andrew Hirmail C.
Ti hooch resolutsioons struktur fon te licht trap 1 komplëks im reaktsioons sentrum kept naye insicht in ti kinone dynamik.
©2021 Amerikanixe Assosiatsioon fer ti Forterung fon te Wërter. ale rechte sin reserwiirt. AAAS is a partner of HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef and COUNTER. ISSN 2375-2548.